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18种天然氨基酸分析(异硫氰酸苯酯柱前衍生法)

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内容节点
概述
实验/设备条件
样品提取
实验/操作方法
实验结果/结论
仪器/耗材清单



方法:

HPLC



基质:

氨基酸注射液、动植物性食品和饲料



应用编号:

102377



化合物:

Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Ser(丝氨酸)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Arg(精氨酸)、Thr(苏氨酸)、Ala(丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(缬氨酸)、Met(蛋氨酸)、Cys(胱氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Trp(色氨酸)、Lys(赖氨酸)等18种天然氨基酸





色谱柱:


Diamonsil AAA 5μm 250x4.6mm




样品前处理:


溶液配制

氨基酸储备液:  称取一定量氨基酸标准品,用0.1 mol/L HCl水溶液溶解,胱氨酸为0.01 mol/L,酪氨酸为0.02 mol/L,其他氨基酸为0.05 mol/L

氨基酸使用液:  将储备液用0.1 mol/L HCl水溶液稀释,得到浓度为0.002 mol/L的氨基酸单标和混标

内标液:  以正亮氨酸作为内标物。称取一定量正亮氨酸,溶于0.1 mol/L HCl水溶液,得到0.02 mol/L的正亮氨酸内标液

异硫氰酸苯酯溶液:  将250 μL异硫氰酸苯酯用乙腈乙腈定容至10 mL,得到0.2 mol/L异硫氰酸苯酯溶液

三乙胺溶液:  将1.4 mL三乙胺用乙腈定容至10 mL,得到1.0 mol/L三乙胺溶液



衍生化



样品溶液衍生化



        量取200 μL 样品溶液(蛋白质水解液或游离氨基酸溶液)[1],置于1.5 mL 塑料离心管中,加入20 μL 正亮氨酸内标溶液[2],混匀,再加入100 μL 1 mol/L三乙胺乙腈溶液和100 μL 0.2 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液,混匀,室温反应1小时,然后加入400 μL正己烷,旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s,静置分层,取200 μL下层溶液与800 μL水混合[3],0.22 μm 针式过滤器过滤,待分析。



标准溶液衍生化

        量取200 μL氨基酸混合标准溶液(每种组分浓度均为0.002 mol/L),置于1.5 mL塑料离心管中,准确加入20 μL正亮氨酸内标溶液[2]、100 μL 1 mol/L三乙胺乙腈溶液和100 μL 0.2 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液,混匀,室温反应1小时,然后加入正己烷400 μL,旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s,静置分层,取200 μL下层溶液与800 μL水混合[3],0.22 μm针式过滤器过滤,待分析。



注:

[1] 通过控制原始样品质量或稀释等方法,使样品溶液中的氨基酸总量不超过0.04 mol/L或3.0 g/L(两者中取Z小值)

[2] 只有采用内标法分析时,才需要加入正亮氨酸作为内标物

[3] 衍生得到的样品溶液中含有50%的乙腈,这与流动相溶剂体系存在较大差距,因而需要加水稀释,否则会引起峰前沿或分叉




色谱条件:


分析条件

仪器: 二元高压HPLC系统

色谱柱: Diamonsil AAA 250 × 4.6 mm,5 μm(Cat.#:99751)

流动相A: 0.05 mol/L乙酸钠水溶液(冰乙酸调节pH值为6.50 ± 0.05)

流动相B: 甲醇 : 乙腈 : 水=20 : 60 : 20(V : V : V)

流速: 1.0 mL/min

检测波长: UV 254 nm

柱温: 45 ℃

进样体积: 10 μL

梯度程序


































时间/min




0




39




40




45




46




60




流动相A/%




95




52




0




0




95




95




流动相B/%




5




48




100




100




5




6




 



文章出处:

迪马科技应用实验室



关键字:

氨基酸注射液, 动植物性食品, 饲料



摘要:


该方法适用于氨基酸注射液、动植物性食品和饲料中Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Ser(丝氨酸)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Arg(精氨酸)、Thr(苏氨酸)、Ala(丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(缬氨酸)、Met(蛋氨酸)、Cys(胱氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Trp(色氨酸)、Lys(赖氨酸)等18种天然氨基酸的检测。




图谱:




18种天然氨基酸、正亮氨酸以及NH3(氨)-异硫氰酸苯酯衍生物的液相色谱图



1 Asp(天冬氨酸) 2 Glu(谷氨酸) 3 Ser(丝氨酸) 4 Gly(甘氨酸)  5 His(组氨酸) 6 Arg(精氨酸) 7 Thr(苏氨酸) 8 Ala(丙氨酸)  9 Pro(脯氨酸) 10 NH3(氨) 11 Tyr(酪氨酸) 12 Val(缬氨酸)  13 Met(蛋氨酸) 14 Cys(胱氨酸) 15 Ile(异亮氨酸) 16 Leu(亮氨酸)  17 Nle(正亮氨酸) 18 Phe(苯丙氨酸) 19 Trp(色氨酸) 20 Lys(赖氨酸)



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