pcr技术原理聚合酶链式反应dna扩增

PCR技术是指，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

总体积：一般为25μl～100 μl

（一）Mg2+:终浓度为1。5～2。0mmol/L，其对应dNTP为200 μmol/L，注意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会YZTaq酶的活性。 Mg2+能影响反应的特异性和产率。

（二）无Mg2+buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会YZDNA聚合酶活性。

（三）BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。

（四）底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7。0～7。5，一般存储浓度为 10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。

（五）Taq酶：能耐95℃高温而不失活，其Z适pH值为8。3～8。5，Z适温度为75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2+浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0。5～5个单位/100μl。

（六）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有YZ作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaD

荧光定量pcr是一种新兴的pcr技术，它通过荧光染料或荧光标记的具有特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，可以实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度，也被称为实时荧光定量pcr。

a、竞争法

选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或GX液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。

b、内参照法

在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或GX液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗di高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，Z终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。

荧光定量pcr是从传统基于凝胶的低通量PCR技术发展而来的高通量的荧光分析技术，是一种实时定量PCR方法。

实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需