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单细胞分选

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单细胞分选

单细胞分选指的是将单个细胞从多个细胞中分选出来。流式细胞分选是对细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。免疫磁珠细胞分选方法可以在几分钟内从复杂的细胞混合物中分离出很高纯度的细胞。

单细胞流式分选特点和应用
单细胞流式分选特点和应用

单细胞流式分选为一种现代细胞分析技术,其用途是定性或定量检测细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等。特点1.流式细胞仪能够以任...[查看全部]

单细胞分选原理
单细胞流式分选原理和应用

流式单细胞分选是对细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。

细胞分选的原理

往样品管中放入胞悬液,经过高压的作用进入流动室内。鞘液充满了流动室,细胞被排成单列,以一定速度,在鞘液的包裹和推动下从流动室喷口喷出。有一个超高频的压电晶体配在流动室的喷口,充电后振动,将喷出的液流断裂为均匀的液滴,在这些液滴之中分散着待测细胞。将正、负不同的电荷充入这些液滴,当液滴往带有几千伏的偏转板流经时,高压电场会使充电液滴发生偏转,向着各自的收集容器落入,而中间的废液容器中则落入没有充电的液滴,从而使细胞的分离得以实现。

流式细胞分选能够以射光的荧光强度和波长为依据分开发光颗粒亚群,从而使单克隆分选实现。可以鉴定、分类、定量和分离复杂样本中的细胞,单次能够同时进行其中一种到四种特定细胞的高速分选纯化、高通量单克隆分选或细胞芯片制备。在培养、移植、核酸提取、单细胞PCR扩增或原位杂交等方面能够直接对分选后的细胞进行使用。能够对细胞基因、蛋白、功能水平以及不同细胞之间的差异化进一步进行研究。硬件中样本细胞只有小于5%的比例,使样本中目标细胞的高回收率得以保证。

应用

细胞结构、活性和功能会受到生物材料的影响。高纯度、高活性的稀有细胞能够通过仪器的分选功能分选得到,能够通过通过直接培养、诱导、增殖、分化、活化和移植等对细胞功能和细胞ZL进行更深一步的探索,还能够基于此对基因组合蛋白质进行逆向研究,对致病基因、致病蛋白和疾病信号传导方式进行寻找。

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单细胞分选特点
单细胞流式分选特点和应用

单细胞流式分选为一种现代细胞分析技术,其用途是定性或定量检测细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等。

特点

1.流式细胞仪能够以任何可以检测到的发光度或荧光散射度差异来对细胞进行分离。若可以使流式细胞仪保持无菌状态,那么分选后的细胞还能够进行培养或其他分析。

2.若细胞分选不多,那么使用流式分选则相对较便宜。

3.当对少量细胞进行分选的时候,流式分选具有较快的速度以及超过99%的精确度。和传统的分选相比,先进的流式细胞仪的分选速度提高了很多倍,能够达到25000个细胞/秒以上,几小时就能完成yi天的工作量。但是108个细胞为流式细胞仪一次分离的Z大合理量。如果细胞量高于109个,那么会影响分选后细胞的活力。

4.能够选同时进行正选负选,多个Marker分选也可以同时进行。以往的流式细胞仪仅可以给液滴充上正电荷或负电荷,所以在电场中只可以两路分选。现在的仪器能够给液滴充不同的电量,从而使液滴的偏转角度得以调整,使多路分选得以实现。

应用

1.细胞内信号传导和生物大分子间相互作用研究;

2.各种病原体如病毒、细菌等基础和致病性和致病机理研究

3.药理药效和药物开发研究

4.移植和细胞ZL研究

5.干细胞组织工程研究

6.细胞增殖、活性和凋亡研究

7.疾病细胞如炎症细胞、肿瘤细胞等的发生、发展和转移研究

8.基因表达和表达调控研究;

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单细胞分选操作规程
流式单细胞分选步骤

流式单细胞分选是对细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。

细胞分选步骤

1.在进行细胞分选之前首先应当做预实验,对流式细胞仪的测定条件进行优化,将分选门建立出来。流速和样品浓度根据目标细胞的含量进行调整。从而使目标细胞通过样品室的浓度为100-300个/秒,200个左右/秒Z好。

2.进入CellQuest,由Aquire菜单连机。

3.将CellQuest中存储的获取窗口打开,将优化后存储的仪器打开,对条件进行设置。

4.将样本管放在进样针处。

5.可以首先对一个数据资料进行收集,比较此数据与用分选后的样本收集的数据,来对分选样本的纯度进行确定。

6.从Acquiremenu选择SortSetup。

7.分选模式以样本中目的细胞的百分比及实验目的为根据来进行决定,分选用的门在SortGate中进行选择。如果选择NoGate(所有细胞),那么不分选只进行获取;如果在SortCount-中选择0,那么进行连续分选;SingleCell、Recovery、Exclusion的某种模式在SortMode中选择,不显示排除细胞数在AbortedCell中选择,之后点击OK。

8.对液流控制键RUN进行点击。

9.对获取控制窗口Aquire进行点击,在完成分选后对Pause,Abort进行点击。

10.将样本管取下,将1mL蒸馏水换上,对获取控制窗口Standby进行点击。

11.将收集锥型管取下,离心浓缩,用培养液重悬,根据实验所需条件来进行培养。

上样后的清洗

在完成分选之后,必须彻底消毒与清洁管路,从而保证分选系统管路无腐蚀、无结晶、不堵塞、不染菌。如果分选实验开始后,每周必须开机,用无菌蒸馏水充分的冲洗分选管路。

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单细胞分选方法
单细胞分选免疫磁珠法

免疫磁珠细胞分选方法可以在几分钟内从复杂的细胞混合物中分离出很高纯度的细胞。

磁分离细胞的重要指标是:

磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小决定了细胞分选的纯度和得率,但是若磁珠太小,则不会有很高的得率,若磁珠太大,则又会对细胞活性产生影响,流式也不能直接上。

目前,在市场上有Small particles (≈50 nm)和MACS Large particles (1200~4500 nm) -others两种磁性细胞分离系统。

大磁珠 

优点:

技术简单,能够在试管中完成分离,细胞用量的增减很容易,不仅有很高的速度以及很高的得率,而且成本也非常低廉。

 缺点:

对细胞有机械压力,会对其生物学活性产生影响,对分离后培养非常不利,具有比较低的纯度,使FCM的喷嘴阻塞了。

小磁珠 

优点:

对细胞温和,分离细胞的后续培养不会受到影响,能够直接上流式检测,不会对散射光产生影响。

缺点:

分离细胞需要很强的磁场,分离的细胞得率比较低且速度不快,在普通试管不能进行,需要一次性的分离柱,需要较为昂贵的成本。

免疫磁珠法分类

免疫磁珠法包括正选法和负选法两种方法:

负选法

磁珠对不需要的细胞进行结合,所需细胞即为游离于上清液的细胞。

正选法:

分离获得的细胞即是磁珠结合的细胞。

通常来说,正选法磁珠的用量要小于负选法。

免疫磁珠法分离细胞原理:

免疫磁珠法分离细胞是以细胞表面抗可以和连接有磁珠的特异性单抗相结合为基础,在外加磁场的作用下,通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而在磁场中滞留,没有此种表面抗原的细胞因为不可以和连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性,不能够停留在磁场中,从而分离出细胞。

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单细胞分选仪器
单细胞分选仪原理、使用和组成

细胞分选仪为使得单细胞分选实现,进而可以对单细胞的培养操纵的工具。如今通常是自动细胞分选仪。细胞分选仪的好坏主要看细胞组织是否被破坏,细胞是否有较高的纯度以及存活率。

仪器组成

自动细胞分选仪通常分为:

1. 1D自动显微操纵单元

2. 12位冷却型荧光CCD相机

3. 注射泵

4. 单细胞自动捕获操纵与沉积的计算机系统;

5. 倒置显微镜;

6. 2D自动控制显微镜平台和自动聚焦单元

仪器使用

荧光细胞在虚拟的培养皿中被标记为绿色小球,细胞的提取通过微量吸液管,通过物镜环在物镜上方固定控制台,在控制台ZX光轴位置固定玻璃微量吸液管,通过LED 灯照射微量吸液管顶端,通过微量吸液管直接将照射光引入到物镜。可通过手动调节弹簧旋钮将微量吸液管上下移动到物镜焦点位置。能够水平移动培养皿,通过挠性导管能够将微量吸液管上端往注射泵上连接。自动细胞分选仪控制台能够通过计算机USB 接口对流体阀和显微LED 照明光源进行控制,同时也能够对显微镜荧光快门进行自由地控制,并且对高速控制阀进行了整合从而使流体得以实现。

仪器原理

自动细胞分选仪是一款配合倒置显微镜使用的,用来筛选、提取、沉积细胞的理想设备。该系统安装操作非常简单,和各种类倒置显微镜的配合也非常的灵活。自动细胞分析仪细胞的分选是使用微量吸液管,50-80um为微量吸液管内孔径范围。

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单细胞分选注意事项
单细胞流式分选指标和注意事项

通过对含有单细胞的液滴进行分离从而实现细胞的分选。有一个超高频的压电晶体配在流动室的喷口,充电后振动,将喷出的液流断裂为均匀的液滴,在这些液滴之中分散着待测细胞。将正、负不同的电荷充入这些液滴,当液滴往带有几千伏的偏转板流经时,高压电场会使充电液滴发生偏转,向着各自的收集容器落入,而中间的废液容器中则落入没有充电的液滴,从而使细胞的分离得以实现。

分选主要主要分为分选得率、分选收获率、分选纯度和分选速度四个指标。

1.分选收获率:

分选收获率是指被分出细胞与原来溶液中该细胞的百分比。一般来说,分选纯度和收获率是成反比的,若纯度降低,那么收获率会提高,若纯度提高,那么收获率会降低。

2.分选得率:

纯度和收获率是指目的细胞的总量从一群体细胞悬液中被分辨出来,再经分选后使目的细胞的实际得率获得。细胞的实际得率和细胞的分选速度有着非常密切的关系。

3.分选速度:

分选速度是指所要细胞每秒能够提取多少个。目前为止,每秒上万个细胞为大型机的Z高分选速度,每秒300个为台式机的分选速度。

4.分选纯度:

分选纯度是指分选出的细胞所占的比例,大约99%的分选纯度台式机和大型机通常都能够达到。

如果想要足够多的符合要求的单细胞通过流式分选出来,那么必须注意以下几点:

1、效率

自动化替代人工使成本得以节约,效率也di一提高。当你需要对超低含量的细胞进行分选时,工程的耗时必定非常长,因此必须考虑鞘液用光时更换繁琐度、耗时、连续性等问题。

2、精度

流式分选的仪器有着超高的精密度,结果的偏差可能仅仅因为稍稍不同的参数的设置。除此以外,既然是对单细胞进行研究,那么就必须使分选得到的确实是单个细胞,不然就毫无意义。

3、活性

对于后续实验来说,细胞活性状态尤为重要,以转录组分析为例,高质量的RNA样本不管是RNA-Seq还是高通量表达谱芯片技术均需要,RNA会由于细胞活性不好或死细胞而直接降解,导致无法继续实验。

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