凝胶渗透色谱测分子量的原理是什么?

一、 凝胶渗透色谱的概述

1. 凝胶渗透色谱的简单回顾
凝胶渗透色谱GPC（Gel Permeation Chromatography）也称作体积排斥色谱(Size Exclusion Chromatography)是三十年前才发展起来的一种新型液相色谱，是色谱中较新的分离技术之一。利用多孔性物质按分子体积大小进行分离，在六十年前就已有报道。Mc Bain用人造沸石成功地分离了气体和低分子量的有机化合物，1953年Wheaton和Bauman用离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质。1959年Porath和Flodin用交联的缩聚葡糖制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品。而对于有机溶剂体系的凝胶渗透色谱来说，首先需要解决的是制备出适用于有机溶剂的凝胶。二十世纪60年代J.C.Moore在总结了前人经验的基础上，结合大网状结构离子交换树脂制备的经验，将高交联度聚苯乙烯凝胶用作柱填料，同时配以连续式高灵敏度的示差折光仪，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱技术。

2. 凝胶渗透色谱的应用
三十多年来，凝胶渗透色谱的理论、实验技术和仪器的性能等方面有了突飞猛进的发展。尤其是随着新型柱填料的诞生、GX填充柱的出现(目前其理论塔板数已超过10000/米)以及计算机的普及，凝胶渗透色谱在工业、农业、医药、卫生、国防、宇航以及日常生活的各个领域得到了广泛的应用。特别是近年来，随着各种高分子材料的问世，人们对高分子科学的不断探索，高聚物的分子量及其分布的测定显得尤为重要，成为科研和生产中不可缺少的测试项目之一。例如：常见的聚苯乙烯塑料制品，其分子量为十几万，如果聚苯乙烯的分子量低至几千，就不能成型；相反，当分子量大到几百万，甚至几千万，它又难以加工，失去了实用意义。科研和生产上通过控制高聚物的分子量及其分布宽度指数D(D=Mw/Mn)、分子量微分分布曲线、分子量积分分布曲线来生产出性能Z佳的高聚物产品。另外，除了快速测定分子量及其分布以外，凝胶渗透色谱还广泛用于研究高聚物的支化度，共聚物的组成分布及高聚物中微量添加剂的分析等方面。如果配以在线的分子量检测器（如：LALLS、Multi-Angle LS、Dual-Angle LS等），凝胶渗透色谱可以测定高聚物的分子量。
凝胶渗透色谱作为一门新兴的科学，随着各种新型检测器的出现（如UV、FT-IR、LS、Viscometer等），它的应用范围也逐步从生物化学、高分子化学、无机化学等向其它领域渗透，成为化学领域内必不可少的分析手段。

二、 凝胶渗透色谱的基本概念

1. 凝胶渗透色谱的分离机理 
目前关于凝胶渗透色谱的分离机理存在着以下几种基本理论：1.立体排斥理论；2.有限扩散理论；3.流动分离理论。除上述理论外，尚有分子热力学理论和二次排斥理论等。由于应用立体排斥理论解释凝胶渗透色谱中的各种分离现象与事实比较一致，因此立体排斥理论已为人们普遍采用。即：它的分离基础主要依据溶液中分子体积（流体力学体积）的大小来进行分离。
凝胶渗透色谱的分离过程是在装有多孔物质为填料的色谱柱中进行的，一个填料的颗料含有许多不同尺寸的小孔（这些小孔具有一定的分布），这些小孔对于溶剂分子来说是很大的，它们可以自由地扩散出入。由于高聚物在溶液中以无规线团的形式存在，且高分子线团也具有一定的尺寸，当填料上的孔洞尺寸与高分子线团的尺寸相当时，高分子线团就向孔洞内部扩散。显然，尺寸大的高聚物分子，由于只能扩散到尺寸大的孔洞中，在色谱柱中保留的时间就短；而尺寸小的高聚物分子，几乎能够扩散到填料的所有的孔洞中，向孔内扩散的较深，在色谱柱中保留的时间就长。因此，不同分子量的高聚物分子就按分子量从大到小的次序随着淋洗液的流出而得到分离。图1是高聚物分子和固定相颗粒间相互作用的示意图。图2是不同尺寸的高聚物分子分离过程的示意图。

2. 凝胶渗透色谱谱图的构成
实验上，在色谱柱后面配以（通用型/选择型）浓度监测器，便可以记录出高聚物的GPC图，如图3所示。

当聚合物样品的色谱图完成以后，经处理的数据，可作多方面的应用。通过观察色谱图可获得很多有用的信息。色谱图中不同的区域与聚合物样品中各成分有关，如果对高分子材料作一次全分析，就可以发现高分子材料的GPC谱图4中：A是高聚物的图谱；B是齐聚物的图谱；C是各种类型添加剂的图谱；D是低分子化合物杂质的图谱。

3. 凝胶渗透色谱中几种常用平均分子量的定义
由于应用统计方法的不同，即使对同一个试样，也可以有许多不同种类的平均分子量。下面是四种Z常用的平均分子量的定义。

式中： Ni：分子量为Mi的分子的个数
Wi：分子量为Mi的组分的重量
α：特性粘度－分子量方程中的常数
其中，数均分子量是按分子数目统计平均而得；重均分子量是按分子重量统计平均而得。这两种平均分子量的物理意义比较明确，而粘均分子量和Z均分子量的物理意义却不太明确。
一般情况下，多分散样品的平均分子量有以下次序：

图5为高聚物四种平均分子量在GPC谱图中的示意图。

4. 高聚物多分散性的表征
高聚物的分子量分布是指样品中各种分子量组分在总量中所占的各自的分量，它可以用一条分布曲线或一个分布函数来表示。分子量分布曲线有两种形式：1.用重量分数W对分子量作图的曲线叫做微分分布曲线；2.用累积重量分布对分子量作图的曲线叫做积分分布曲线。样品间分子量分布宽度的比较，Z直接的方法是将实验所得到的分子量分布曲线作对比。还有一种更一般化且Z常用的定量方法就是重均数均比，即：Mw/Mn。目前实验上能够合成的"单分散"样品、一般多分散样品、分子量分布比较宽的样品的Mw/Mn值如表1所示。

表1.几种合成高聚物的Mw/Mn值

图6是样品的GPC图及样品的分子量分布的微分分布曲线、积分分布曲线的示意图。

图6.GPC谱图、微分分布曲线、积分分布曲线示意图

5. 高聚物的分子量及其分布的测定
用凝胶渗透色谱测定高聚物的分子量及其分布是种相对的测试方法。首先要制取适合被测样品的logM-Ve标定线（工作曲线）。目前人们制定标定线比较常用的方法主要是以下两种：
〖1〗.单分散标样制定标定线
所谓单分散标准样品是指高聚物的Mw/Mn值在1.05~1.10以内。此方法类似于其它化学分析上的工作曲线法。它的前提是能够获得一系列（不同分子量）被测样品的单分散标样，用这些单分散标样来制得logM-Ve标定线；然后，以此来测定样品。图7所示为单分散标样的校正线绘制过程示意图。

〖2〗.普适校正法
这种方法是用流体力学体积[η]•M作为通用校正参数，也被称作普适校正法。不同高聚物在同样实验条件下进行凝胶色谱的实验，若淋洗体积Ve相同，则这两个高聚物的流体力学体积相等。即：

[η]1•M1=[η]2•M2

上式中K1、K2、α1、α2在固定条件下是常数，只要知道两种高聚物在该条件下的参数K1、α1及K2、α2值，就可由diyi种高聚物（标准样品）的logM-Ve标定线，应用③式直接求出第二种高聚物（被测样品）的logM-Ve标定线。目前，人们普遍采用市售的单分散聚苯乙烯（PS）标样来作为diyi种高聚物，然后查取（或采用其它的实验方法测得）聚苯乙烯标样及被测样品在测定条件下的K值（K1、K2）和α值（α1、α2），经过上述转换便可求出被测样品的分子量。目前由于计算机的引进，上述转换可在测定样品的同时由GPC软件实行自动转换。
除上述两种常用的方法外，还有，窄分布的高聚物级分订定的标定线；渐近试差法订定的标定线；无扰均方末端距h02用作通用校正参数；高分子链有扰均方末端距h2用作通用校正参数等。

三．凝胶渗透色谱仪的基本结构
简单地说，凝胶渗透色谱仪由以下四部分构成：1.输液系统（包括溶液储存器、输液泵。进样器等），2.色谱柱系统（包括柱温控制箱），3。检测器（RI、UV等），4.数据收集及数据处理系统（包括模数转换器、计算机、打印机/绘图仪等）。其流程图如图8所示。

图8.凝胶渗透色谱仪的流程图
（图中：-：液路，……：电路）

总之，大量的数据证明，任何材料的宏观性能都与其微观结构有着密切的联系。高聚物的分子量及其分子量分布是高聚物结构中两个重要的参数。凝胶渗透色谱技术的发展，大大推动了高聚物分子量、分子量分布与其性能间关系的研究，同时，GPC已成为分离分析科学家族中不可缺少的一名成员。