免疫组化方法、操作步骤和结果分析

免疫组化概念及原理

免疫组化，全称是免疫组织化学，又称免疫细胞化学，是组织化学的一个分支。免疫组化是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。

免疫组织化学利用抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

免疫组化技术分类

免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自显影法等。

这些常用免疫组织化学方法的原理如下：

1. 免疫酶细胞化学技术

免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。是目前免疫组织化学研究中Z常用的技术．基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组织内的相应抗原进行定位或定性研究。

免疫酶标方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等。

2. 免疫荧光细胞化学技术

将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光,从而可以确定组织中的抗原定位或定量。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。

3. 免疫胶体金技术

就是用胶体金标记一抗，二抗或其他的能特异性的结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针对组织或细胞内的抗原进行定性，定位或定量研究．由于胶体金的电子密度高，多用于免疫电镜的单标记或多标记的定位研究。

免疫组化操作步骤

1. 切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行

2.缓冲液洗 3min/2 次。

3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。

4. 缓冲液洗 5min/2 次。

5. 滴加 Ultra V Block ， 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。

(注:孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 - 10% 正常羊血清，这一步可以省略。)

6. 缓冲液洗 5min/2 次。

7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 - 2 小时。(具体孵育时间和温度由试验者Z终决定)

8. 缓冲液洗 5min/2 次。

9 . 滴加 Primary Antibody Enhancer(增强子)，在室温下孵育 20 分钟。

10 .缓冲液洗 5min/2 次。

11 .滴加 HRP Polymer(酶标二抗) ，在室温下孵育 30 分钟。

(注:HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。)

12 .缓冲液洗 5min/2 次。

13 .向 1ml DAB Plus Substrate (或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen (或 AEC Plus Chromogen)，混匀后滴加到切片上，孵育 3 - 15 分钟。(具体时间由染色深浅决定。)

14 .自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

免疫组化结果分析

采用半定量方法判定蛋白的表达等级。具体来说，即分别对镜下阳性细胞的百分比和染色强度给予评分；阳性细胞百分比：0％计为0分，1％～25％计为1分，26％～50％计为2分，51％～75％计为3分，76％～100％计为4分；阳性着色强度：无色计为0分，淡黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色计为3分。两者计分相乘即为表达等级：0-4分为低表达，5-12分为高表达。

免疫组织化学的应用

免疫组织化学的临床应用主要包括以下几方面： (1)恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断； (2)确定转移性恶性肿瘤的原发部位； (3)对某类肿瘤进行进一步的病理分型； （4）软组织肿瘤的ZL一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的； （5）发现微小转移灶，有助于临床ZL方案的确定，包括手术范围的确定。 （6）为临床提供ZL方案的选择。