共焦显微镜[Confocal Laser Scanning Microscope(CLSM或LSCM)]在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(Beam Splitter),将已经通过透镜的反射光折向其它方向,在其焦点上有一个带有针孔(Pinhole)的挡板,小孔就位于焦点处,挡板后面是一个 光电倍增管(photomultiplier tube,PMT)。可以想像,探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统,必不能聚焦到小孔上,会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。
共聚焦显微镜基本原理
传统的光学显微镜使用的是场光源,标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰;激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描,标本上的被照射点,在探测针孔处成像,由探测针孔后的光电倍增管(PMT)或冷电耦器件(cCCD)逐点或逐线接收,迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔,焦平面以外的点不会在探测针孔处成像,这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面,克服了普通显微镜图像模糊的缺点。
共聚焦显微镜应用领域
涉及医学、动植物科研、生物化学、细菌学、细胞生物学、组织胚胎、食品科学、遗传、药理、生理、光学、病理、植物学、神经科学、海洋生物学、材料学、电子科学、力学、石油地质学、矿产学。
共聚焦显微镜使用注意事项
1 关机时一定等激光冷却后再按下开关(Remote Switch)关机。
2 汞灯电源关断后,再开启汞灯要等30分钟以上。
3 使用中不得随意关断显微镜、控制箱等的电源。
4 装卸物镜、DIC片要轻拿轻放,勿震动。
5 油镜用后一定清洁, 不得使用二甲苯。
6 平时注意整机防尘。
7 如果本机长期不用, 请确保每周至少开机一次. (开机预热1小时, 运行1小时)
共聚焦显微镜优点
1、以激光为光源,在相应的荧光探针标记后,对样本进行逐点扫描,逐层获得二维光学横断面图像,具有“细胞CT”的功能,并可通过计算机三维重建软件支持,获得三维图像,并可以任意角度旋转,观察细胞,组织立体形态和空间关系;
2、可以对活细胞和组织进行无损伤的观察,动态测量细胞内的Ca离子浓度和pH值等活细胞生理信息;
3、可对细胞膜的流动性,细胞间通讯,细胞融合,细胞骨架弹性测量等,可用作“光刀子”完成细胞内“外科手术”。这一技术可以对活细胞和组织进行原位动态定量的观察和测量。
共聚焦显微镜操作方法
(1)开启仪器电源及光源:一般先开启显微镜和激光器,再启动计算机,然后启动操作软件,设置荧光样品的激发光波长,选择相应的滤光镜组块。以便光电倍增管(photo multiplier tube,PMT)检测器能得到足够的信号结果。使用汞灯的注意事项同普通荧光显微镜。
(2)设置相应的扫描方式:在目视模式下.调整所用物镜放大倍数,在荧光显微镜下找到需要检测的细胞。切换到扫描模式,调整双孔针和激光强度参数,即可得到清晰的共聚焦图像。
(3)获取图像:选择合适的图像分辨率,将样品完整扫描后,保存图像结果即可。
(4)关闭仪器:仪器测定样品结束后,先关闭激光器部分,计算机仍可继续进行图像和数据处理。若要退出整个激光扫描共聚焦显微镜系统.则应该在激光器关闭后,待其冷却至少10分钟后再关闭计算机及总开关。
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