- 为您推荐: 徕卡共聚焦显微镜
共聚焦显微镜与传统显微镜相比,具有高分辨率、高灵敏度、高放大率等特点。随着软件开发和应用技术的完善,共聚焦显微镜已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
共聚焦显微镜样品制备是检测前的关键步骤。样品需经荧光探剂标记(单标、双标、三标)。
标本可以是固定的或活的组织,也可以是固定的或活的贴壁培养,细胞应培养在Confocal专用小培养皿或盖玻片上,悬浮细胞,甩片或滴片后,用盖玻片封片。样品的Zda厚度约1~2mm,使用的盖玻片厚度应小于0.17mm,载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间,而且表面光洁,厚度均匀,没有明显的干扰荧光。固定样品常用封片剂进行封片,常用PH8.5-9的PBS配制的甘油封片。
常规样品制备要求:
1、染料的选择
由于共聚焦显微镜是以单一波长的激光作为光源,因此在选择荧光染料时要根据共聚焦显微镜配备的激光器波长选择,如果在同一样品中有多种荧光染料标记,还要考虑它们的发射波长尽量不要重叠,避免串色问题。
2、样品承载物的选择
一般的共聚焦显微镜高倍物镜均为油镜,它的数值孔径较小,要求镜头与样品之间的工作距离不大于0.17mm,因此如果观察样品为贴壁细胞或组织切片,可以用普通的载玻片和盖玻片即可。如果是悬浮细胞或悬浮粒子,可以用共聚焦显微镜专用的培养皿承载样品进行观察。
3、封片剂的选择
如果样品只需要观测一次并且不是极易淬灭的荧光,可以选用一定浓度的甘油混合液封片即可。如果样品需要放置一段时间并多次拍摄,应选用抗荧光淬灭的封片剂,以减少荧光信号丢失。
徕卡 共聚焦显微镜 STELLARIS
①根据荧光探针的激发波长和发射波长,选择合适的激光器、激光功率,分光镜滤片和发射滤片。
②确定扫描方式:点、线、面、三维扫描。
③确定扫描密度(分辨率):256×256、512×512、1024×1024、2048×2048,分辨率越高,扫描速度越慢,图像信噪比越好,但也越容易发生光漂白。
④选取共聚焦显微镜物镜的倍数及电子放大倍数:这个条件被确定后,扫描范围即被确定,物镜的光透射率与数值孔径(NA)的4次方成正比,与物镜的放大倍数的平方成反比,因此,应尽量选择高数值孔径的物镜。
⑤根据样品的制备质量选择合适的针孔大小,调整激光管电压、光电倍增管功率、降噪等至Z佳状态,这些参数选择或设置有非常密切的关系,选择时应综合考虑。
⑥确定光切范围,即扫描样品的厚度,锁定起始位置和结束位置。
⑦给出光切的层数及取图时累计平均次数。
⑧获取图像并保存。
使用共聚焦显微镜,必须注意以下几点:
①严格按照使用规程操作,不得任意改变操作程序,共聚焦显微镜中的激光发射管使用寿命有限且价格昂贵。所以,在操作使用过程中切记,在开关的启动顺序以及在扫描过程中努力做到保护好激光管。
②注意不要暴露在中等功率和高功率的激光辐射中,特别要注意不得注视激光束,甚至不要观看样品:不得在共聚焦显微镜附近储存或使用易燃易爆物的同体、液体或气体:可以引燃的材料如布或纸张不得放入光路中。
③开机或改变激光功率后,约需20min激光光源才能够达到稳定,关闭共聚焦显微镜系统时,先关闭计算机,等氩离予激光器风扇关闭时,方可关闭系统开关。
④扫描后的图像储存在计算机内,可作进一步处理。由于计算机的硬盘有限,应及时储存到用户软盘上,但要警惕任何病毒浸染激光共聚焦显微系统。使用前要严格把关,检查软盘是否携带病毒。
共聚焦显微镜作为使用率极高的大型精密仪器,它的正常运转离不开科学的日常管理。
1、负责人管理制度
为共聚焦显微镜指定仪器负责人,由专人负责仪器的开关机,规范的开关机对于共聚焦显微镜,尤其是激光器及汞灯的维护极为重要,并由负责人每天检查仪器的运行状态。
2、仪器预约使用
激光器和汞灯均属于耗材性的配件,使用寿命有限。尤其是激光器,价格昂贵,在几万至几十万元不等。充分利用好仪器的开机时间,避免共聚焦显微镜空转显得格外重要。一旦出现超过半小时以上的空档时间,由共聚焦显微镜负责人及时协调仪器使用,通知预约较晚时间点的人员提前使用,避免共聚焦显微镜开机空转造成的浪费。
3、使用光盘或者网盘保存数据
严禁插拔U盘或者硬盘拷贝数据,使用仪器共享管理系统的网盘传输或者光盘刻录数据结果,杜绝病毒侵染共聚焦显微镜系统。
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