荧光显微镜的校准规范

　　荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜是基于荧光成像进行光度分析的光学测量仪器，广泛用于生命科学研究和临床实验室诊断等领域。

荧光显微镜的校准

　　荧光显微镜比普通显微镜复杂，使用也比较麻烦，但只要注意下面几点，用户自行作些校准还是很容易的。

　　1、汞灯的校准

　　基于荧光显微镜的原理，决定了选用汞灯作为其光源。由于标本产生的荧光比较弱，为了得到较亮的图像，汞灯的校准至关重要。具体校准步骤如下：

　　①开启汞灯后，在荧光显微镜工作台上放一张白纸，并从物镜转换器中转出物镜，即转换器上出现的空孔位于光轴上，卸去转换器上保护盖(如无空孔，可卸掉一个低倍物镜，校准完毕后再旋上)。转动荧光显微镜主体内的滤光片座，选一个透过绿光的滤光片组，使反射照明有光通过物镜转换器孔，此时在白纸上可以看到汞灯照亮的光斑。如光斑太亮，可以插入中性滤光片，或带上太阳眼镜，以保护眼睛。

　　②转动聚光镜调焦旋手，使汞灯光弧在白纸上成像清晰。因汞灯室内装有一个球面反光镜，用来增加亮度，于是在白纸上看到两个光弧的像。旋转汞灯调节旋手和反光镜位置调节旋手，使两个光弧并立。再转动反光镜聚焦调节旋手，使两个光弧有接近相等的亮度。

　　③旋转汞灯调节旋手和反光镜位置调节旋手，使两个光弧重合。再调节聚光镜调焦旋手，得到放大和均匀的光弧像。这样汞灯校准工作就完成了。转入物镜后，根据物镜具体倍率，稍微调节一下聚光镜调焦旋手就可以了。

　　2、孔径光阑和视场光阑的校准

　　一般荧光显微镜均采用柯勒照明。所谓柯勒照明是一种能够得到图像Zda对比和Zda分辨的折中方法。这时，灯丝成像在孔径光阑上，一般也成像在物镜Z后一片镜框上。孔径光阑是限制光源大小的光阑，而视场光阑是限制人眼在目镜里看到视野大小的光阑。只有在正确校准柯勒照明的条件下，荧光显微镜才能获得它的Z佳光学性能。

　　柯勒照明校准方法如下：

　　①调焦：把样品放在工作台上，沿光轴方向移动工作台或物镜，对样品进行调焦，使成像清晰。

　　②打开孔径光阑，把孔径光阑开到Zda。

　　③关小视场光阑，于是在视场里可以看到视场光阑的影子，即周围一圈变暗，只有中间是亮的。调节聚光镜上下位置，使视场光阑边缘清晰。调节聚光镜上调中螺丝，使视场光阑居中。然后再调大视场光阑，使它略大于目镜视场。

　　④减小孔径光阑，一直到视场里看到Z好的像为止，一般孔径光阑为其Zda时的70%。

荧光显微镜使用注意

　　①滤光片的选用：荧光显微镜一般都带有各种波长的激发和截止滤光片，根据具体测试样品，即能够激发荧光的紫外光波长，来选择激发滤光片(组)。再根据所激发的荧光波长来选择截止滤光片(组〉。

　　②物镜：应选用荧光物镜，物镜外壳上有F、F1或Flou等标志。这种物镜紫外光透过率高，自身又不会产生荧光而降低衬度。物镜使用浸油时，也应选用无荧光浸油。

　　③透射式荧光显微镜效果不如反射式荧光显微镜，所以己较少使用。使用透射式荧光时，标本应做得尽量薄一点，以减少标本对光的吸收损失。

　　④荧光总是很微弱的，所以Z好在暗室里使用荧光显微镜。

　　⑤CCD的灵敏度大大高于人眼，可以采用数码相机或CCD装置，在显示器屏幕上观察图像。

　　⑥汞灯开启后要等15min才能使用;关闭后要等半小时才能再开。汞灯寿命只有200～400h，如果荧光非常暗，又没有汞灯开启时间计数器，就应当检查汞灯寿命是否已到，备用灯泡，以便及时更换。

　　⑦测试间隙时，应拉动遮光板把荧光挡住，防止紫外光长期照射样品，使荧光色素褪色。