相差显微镜的原理|特点

　　相差显微镜能观察到透明样品的细节，适用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖情况及细微结构的观察。相差显微镜是微生物学、细胞生物学、细胞和组织培养、细胞工程、杂交瘤技术等现代生物学研究的必备工具。

相差显微镜的工作原理

　　显微镜检查时，视场中的样品只有在其透射光的波长(颜色)和振幅(亮度)与周围介质有明显变化时，才能被眼睛所分辨。照明光线通过无色透明的物体时，透射光的波长和振幅都不发生明显改变，尤其是振幅，几乎无变化。用普通光学显微镜观察时，难以辨清这样物体的结构，必须借助于相差显微镜，使用固定和染色等理化方法，使样品和背景的透射光在波长或振幅上发生变化，即在颜色和亮度上有所差异，以供识别。

　　一束光线在透过折射率不同的透明介质后，产生的衍射光和透过的直射光的波长没有明显变化，只是衍射光的振幅稍小于直射光，这也是透明不均质物质产生些许明暗变化的原因，但这一点变化很小，并不能有效分辨。变化明显的是衍射光相对透射光在相位上有1/4λ的滞后，虽然人眼不能分辨相位的差别，但可以分辨振幅和波长的变化。相差显微镜就是利用这一点，将相位的差别转变成振幅的变化，也就是将本来均为透明但折射率不同的各个结构显现出明暗差距，从而可以被清楚地分辨。

　　可见光光线通过介质水或其他小分子匀质物质时，由于介质分子远小于可见光波长，所以光的衍射现象并不明显，可以说透射光是直射光。但当可将光透过细胞结构或其他粒径与入射光波长相近的物质结构时，就会产生明显的衍射现象，透射光转化为衍射光。也就是说，细胞等常见观察物的结构大小刚好可以使可将光产生衍射现象。相差显微镜就是利用这一点。光波通过小颗粒的物体后产生直射光和衍射光，衍射光的光波振幅小，相位滞后。在光学系统中，这种直射光和衍射光相遇或光的叠加，振幅发生变化，光线或明或暗，就是光的干涉现象。

相差显微镜的特点

　　相差显微镜把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ(波长)，如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。

　　在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处：

　　1、环形光阑：位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。

　　2、相位板：在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种：

　　①A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差(或称负反差)。

　　②B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差(或称正反差)，结构比周围介质更加变暗。

相差显微镜使用注意事项

　　为了更好地发挥相差显微镜的效果，应注意以下几个方面。

　　1、光源强：光源要强，相差显微镜聚光镜中的环状光阑遮掉大部分光源，所以应将视场光阑和孔径光阑完全开启。

　　2、单色光：为了获得良好效果，相差显微镜应使用波长范围窄的近于单色的光源，相位的变化常因照明光线的波长而不同。通常采用绿色滤光片来调整光源波长，Z好按厂家专用相衬镜检的绿色滤光片进行镜检。

　　3、切片薄：切片不能太厚，以5~10μm左右为宜，或者更薄。如果样品过厚，样品的上层是很清楚的，深层则会模糊不清并且会产生相位移干扰及光的散射干扰，影响相差显微镜成象质量。

　　4、盖玻片和载玻片：载玻长、盖玻片的厚度应符合标准，且不应有疵痕，制片的封固剂应均匀一致。如果有划痕，厚薄不均或凹凸不平，则会产生亮环歪斜及相位干扰。玻片过厚或过薄会使环状光阑亮环变大或变小。相差显微镜观察时要盖上盖玻片，否则环状光阑的亮环和相板的暗环很难重合。

　　5、物镜与聚光镜匹配：注意相差物镜和聚光镜里的相差环要调成对应的。简单的方法就是物镜上的Ph标示与聚光镜上的标示相同，换物镜时一定要记得把聚光镜转到对应的位置。

　　6、相位倒转：当n'<n或n'>n时相差显微镜得到象的明暗反差正好相反，称为相位倒转。当相位差δ=0时是无法识别的，随着δ的增大反差变大，当δ继续增大到某一值后会出现相位倒转。用90%高吸光值(高反差)物镜时，这个转变值约为0.55λ，用70%标准吸光值的物镜时约为0.33λ。较高吸光值的物镜应该用于分辨较小的光程差。

　　7、晕轮和渐暗效应：在相差显微镜成象过程中，某一结构由于相位的延迟而变暗时，并不是光的损失，而是光在象平面上重新分配的结果。因此在黑暗区域明显消失的光会在较暗物体的周围出现一个明亮的晕轮。这是相差显微镜的缺点，它妨碍了精细结构的观察，当环状光阑很窄时晕轮现象更为严重。相差显微镜的另一个现象是渐暗效应，指相差观察相位延迟相同的较大区域时，该区域边缘会出现反差下降。