扫描电镜生物制样

　　生物样品具有含水量高、质地柔软、导电性差、容易变形等特点，因此采用扫描电镜观察生物样品时，必须对样品进行必要的处理。

扫描电镜生物样品制备要求

　　①样品要尽可能干燥，若样品中含有水份，水分挥发会造成仓内真空度急剧下降，导致图像漂移，有白色条纹，甚至会影响灯丝寿命;

　　②热稳定性好，热稳定性差的样品往往在电子束的轰击下分解，释放气体和其他物质，污染扫描电镜;

　　③导电性好，导电性差的样品会发生荷电效应，造成图像畸变，亮点亮线，像散等;

　　④不含强磁性，强磁性的样品观察一般会出现严重的像散，无法消去，磁性粉末如果粘的不牢固还可能会吸附到探头上，损害扫描电镜。

　　扫描电镜生物样品通常指的是动物的体液、肌肉、毛发和一些组织器官，植物的根、茎、叶、果实等，以及各类微生物(细菌、真菌等)。生物样品的含水量高，一般为70%-80%，只有少数的样品，如一些花粉、毛发等可以直接放入扫描电镜中观察，大部分生物样品需要经过脱水干燥处理后才能进行观察。

　　扫描电镜生物样品制备的关键步骤是干燥，应尽量减少因水分蒸发导致的形变。大多数动植物，特别是柔软的细胞和组织，在干燥时由于体积应力和表面张力的作用，容易发生明显的塌陷和变形，造成形貌失真。

扫描电镜生物样品制备方法

　　取材：

　　一般使用锋利的刀片将样品切成5mm见方，高度3mm左右，在满足观察条件的前提下，样品小一些更好，一方面临界点干燥仪的样品仓较小，另一方面，小的样品尺寸固定液更容易渗透到样品内部，固定效果更好。取材完成后，先进行清洗(超声清洗3-5min)，再迅速地放置到固定液中，放置样品脱水皱缩。

　　固定：

　　临界点干燥法前处理常用的固定剂有戊二醛和四氧 化锇。

　　戊二醛是一种五碳醛，一般配制浓度为1-4%，常用浓度为2.5%(PH7.2-7.4)。一般市场上所售卖的戊二醛浓度为25%，使用前需要对其稀释。温度较高或者碱性条件下，戊二醛容易发生聚合失去醛基，降低交联能力，因此，一般使用0.1M的磷酸缓冲液作为溶剂稀释戊二醛，并在4℃下保存。

　　特别注意，戊二醛对皮肤有硬化作用，皮肤粘上会变黄，难以洗掉，所以使用时一定要带手套。

　　它的反应速度快，是优良的前固定剂。用戊二醛前固定的样品不易变脆，可以进行长时间固定(但Z好不要超过一个星期)，因而适用于远离实验室或野外现场取材。但戊二醛对于含脂类较多的样品固定效果不佳，如细胞膜。

　　四氧 化锇是一种很强的氧化剂，一般配制浓度为0.5-2.0%，常用浓度为0.5-1.0%(PH7.2-7.4)。它具有很强的毒性，四氧 化锇气体对呼吸系统有刺激，对眼睛有严重的破坏作用，因此在使用时应特别小心，尽可能在通风橱中进行，并且严格控制用量。但它作为固定剂拥有一些独特的优点：

　　①四氧 化锇可以与脂类、糖类和蛋白质反应。其对脂类的固定作用可以补充醛类固定剂对脂类固定不足的缺点。

　　②用四氧 化锇固定材料时，被还原的锇能沉积在样品表面上，能增加膜的反差，起到“电子染色”作用，往往细胞膜结构比较清晰。

　　因此，含脂类物质比较少的生物样品(如植物类)，采用戊二醛固定，将采取的样品泡入2.5%的戊二醛溶液中浸泡超过4h即可。对于含脂类物质较多的样品(如细胞膜)，采用戊二醛和四氧 化锇双重固定，先在2.5%的戊二醛溶液中浸泡3h以上，再浸泡在1%的四氧 化锇1h。

　　漂洗：

　　用0.1M的磷酸缓冲液(PBS)冲洗4次，每次20min，洗净固定液。

　　脱水：

　　配置浓度分别为30%，50%，70%，90%，1**%的酒精，用不同浓度的酒精溶液逐级脱水，从低浓度到高浓度(30%2次，50%2次，70%1次，90%1次，1**%两次)浸泡1-2次，每次10min。

　　置换：

　　将脱水后的样品浸泡在醋酸异戊酯溶液中15min左右，醋酸异戊酯的极性较低，临界点干燥时，能够更好地与二氧化碳置换，干燥效果更好。

　　干燥：

　　采用二氧化碳临界点干燥仪进行干燥。此方法是根据物质处在临界点时的特殊物理状态设计的一种干燥方法。在临界状态下，液体和气体的密度相等，气液界面完全消失，液体的表面张力系数为零。简单来说就是，通过消除样品表面张力、使得扫描电镜样品在不受表面张力损伤的条件下干燥。

　　经过以上步骤，就能得到饱满的不皱缩的扫描电镜生物样品了。