流式细胞样品制备的注意事项

众所周知，流式细胞分选技术是利用流式细胞分选仪，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度。下面就让小编带你简单了解一下流式样品制备中的注意事项。

一、荧光素和抗体的选择

1)荧光素的选择

如今，国内很多引进的流式细胞仪只装了一个激光光源，就是488nm光源，因此我们需要选择可以被488nm激光激发的荧光素。例如：

检测细胞DNA与RNA含量：PI、7-AAD。

检测细胞蛋白、抗体或者抗原：FITC、PE、Per-CP、PE-CY5、PerCP-CY5.5。

检测细胞膜电位：Rho-123。

检测Ca2+:Fluo-3.

2)抗体的选择

必须选择流式用单克隆抗体，这一类抗体在制备的过程中质控非常严格。

二、样品的准备

有三个评价样品制备优劣的指标：

1）细胞的密度，细胞的密度不能小于1*10的六次方/ml。

2）非特异荧光，不超过百分之一。

3）细胞的碎片或者聚集体，不能出现肉眼可见的团块。

流式样品制备过程中的常见问题和方法

问题：细胞密度低

原因：制备过程中细胞损失

方法：增加离心时间、吸弃上清。

问题：非特异荧光强

原因：抗体不纯，死亡细胞多

方法：选择高纯度的抗体，用同型对照抗体或双标记排除非特异荧光。

问题：碎片多

原因：细胞死亡，机械损伤

方法：在细胞生长状态良好时检测，防止反复吹打。

问题：细胞聚集

原因：消化不完全，酒精固定造成的细胞粘连

方法：彻底消化、在用酒精固定细胞时加入终浓度为百分之1.5-3的小牛血清。

问题：荧光弱

原因：灵敏度不够，抗体加入量不饱和，反应时间少

方法：改用生物素-亲和素，增加抗体的用量，延长反应的时间

问题:检测不出二倍体峰

原因：凋亡测试的方法不对

方法：改用原位末端标记或者PI与Annexin-V双标记法