膜片钳离子通道有哪些研究方法

需要综合应用各种技术研究离子通道结构和功能，所需的技术包含化学技术、基因重组技术及一些物理、通道药物学、人工膜离子通道重建技术、纯化等生化技术、通道蛋白分离、单通道电流记录技术和电压与电流钳位技术。

通蛋离、通建和基重术

为了能够测定各亚单位多肽的分子量，需要使用与通道特异结合的毒剂标记，从而从细胞膜上分离并且纯化通道蛋白质。然后将分离纯化后的通道蛋白质加入人工膜，能够使得通道功能重新恢复。将含有与该种通道蛋白相关的mRNA从细胞中分离出来，然后加入某种细胞（如大肠杆菌），经逆转录得到cDNA。将cDNA用限制性内切酶切割成特定片段，再用核酸杂交方法钓出特定的DNA并克隆。通过对阳性克隆DNA的核苷酸顺序进行测定从而对相应的蛋白质氨基酸序列进行结果的推断，这就是确定蛋白质氨基酸序列的基因重组技术的程序。

通道药物学研究

为了研究通道药物对通道各种功能的影响，需要应用电压钳位或单通道电流记录技术，通过在不同的时间，不同的地方（膜内侧或外侧），分别施用各种浓度的药物。和对药物分子结构的了解相结合。不仅能够对药物和毒素对人和动物生理功能作用的机制进行深入地了解，而且还能够得到分子水平上通道功能亚单位的类型和构象等信息。

单通道电流记录技术

又被叫做膜片钳位技术，在细胞表面用特制的玻璃微吸管吸附，让其形成10～100GΩ的密封（giga-seal），被孤立的小膜片面积是μm2量级，这里面只有很少的离子通道，然后对膜片实行电压钳位，能够对单个离子通道开放产生的pA(10-12安培）量级的电流进行测量。由对单个通道开放和关闭的电流变化进行观测，就能够可直接得到各种离子通道开放寿命分布、开放几率、开放的电流幅值分布等功能参量，并能够对它们与膜电位、离子浓度等之间的关系进行分析。还能够从细胞膜上分离出吸管吸附的膜片通过膜的外侧向外或膜的内侧向外等方式进行实验研究。这种技术便于药物的施加，膜内外溶液成分的改变以及小细胞的电压钳位。

电压钳位技术

通常来说，膜对某种离子通透性的变化是膜电位和时间的函数。为了测定该膜电位条件下离子电流随时间变化的动态过程需要经过玻璃微电极与细胞膜之间形成紧密封接，利用电子学技术施加一跨膜电压并把膜电位固定于某一数值。可以通过对细胞内外的溶液成分的改变或者药物施加，从而导致他离子通道失效，就能够使得被研究的某种离子通道的功能性参量被测定。通过对离子电流的稳态和动力学与膜电位、离子浓度等之间的关系进行分析，可以对该种通道的电导、活化和失活速率、离子选择性等进行推断，并且可以对通道的门控电流的特性进行测量和分析。