PCR假阳性的原因和对策

对特定的DNA片段起到放大扩增作用的一种分子生物学技术，被称为聚合酶链式反应。其可以被当作生物体外的特殊DNA复制，能够大幅增加微量的DNA。1971年Khorana首先提出设想，1985年Mullis发明了聚合酶链反应。下面就让小编带你了解一下PCR反应假阳性的原因和对策。

出现的PCR扩增条带和目的靶序列条带相同，甚至有更高的亮点，也更加的整齐。

引物设计不合适：

选择的扩增序列和非目的扩增序列有同源性，，所以当进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。容易出现假阳性很有可能是因为引物太短或者靶序列太短，需要对引物重新设计。

靶序列或扩增产物的交叉污染：

有两种导致这种污染的原因

1.原因：整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。

解决方案：在操作的时候应该小心轻柔，避免靶序列从离心管

溅出或者被加样枪吸入其中。对除了不能耐高温的物质以及酶以外，对于任何试剂或器材都应该高压消毒，所用所用离心管及样进枪头等都只能够使用一次。如果有必要，在对标本进行添加之前，需用紫外线对反应管和试剂进行照射，从而对存在的核酸进行破坏。

2.原因：空气中的小片段核酸污染，和靶序列相比较，这些小片段更加的短，然而具有一定的同源性。，能够互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，从而造成产生假阳性。

解决方案：可用巢式PCR方法来减轻或消除。

出现非特异性扩增带

和预计的不相同，PCR扩增后出现的条带不是更大就是更小，或者非特异性扩增带和特异性扩增带同时出现。

原因：

1.引物与靶序列不完全互补或者物聚合形成二聚体。

2.出现非特异性扩增带因素很多，PCR循环次数过多有、Mg2+离子浓度过高以及退火温度过低都有可能导致出现非特异性扩增带。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶不会出现非特异条带，而另外一来源的酶则则很容易出现。当酶量过多的时候，也有可能会有非特异性扩增

对策：

有必要对引物进行重新的设计。对酶的来源进行调换或者对酶量进行降低。对引物量进行降低，对模板量进行适当增加，对循环次数进行减少。对二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）进行使用或者对退火温度进行提高。

出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增的时候，有时也会有涂抹带或片状带或地毯样带出现。

原因：

导致这种现象的原因有很多，比如过多的循环次数，过低的退火温度，过高的Mg2+浓度，过高的dNTP浓度，退火时酶量过多或酶的质量差，过高的g2+或者dNTP浓度。

对策：

1.使用其他来源的酶或者对酶的量进行减少。

2.对循环次数减少，对模板量增加，对Mg2+浓 度和dNTP的浓度适当的降低。