PCR引物设计的目的和原则

PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶Z适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。下面就让小编带你了解一下PCR引物设计的目的和原则。

引物设计的目的

为了找到一对合适的核苷酸片段，从而能够对模板DNA序列进行有效地扩增。

引物设计的重要原则

使得特异性和扩增效率Zda限度地提高，同时使得非特异性扩增尽可能的减少。

引物设计的基本原则

1.不能修饰引物的3′端，可以修饰引物的5′端

PCR产物的长度取决于引物的5′端，扩增的特异性不太受到引物的5′端的影响，引物的5′端能够被修饰但不对扩增的特异性产生影响。

因为延伸是以3′端为起点的，因此，3′端不可以进行任何修饰。

2.互补序列不应该存在于引物自身和引物之间

不能有3个以上的引物自身连续互补碱基，不能有4个以上的引物之间连续互补碱基，特别需要防止3′端的互补重叠。

3.引物中四种碱基Z好随机分布

避免连续的3个G或者C出现在引物的3′端，防止在G+C富集序列区域引物产生错配，从而使得扩增的特异性降低。

4.Z佳退火温度为55-60摄氏度，Tm差值应低于1摄氏度

通常情况下，PCR的Z适退火温度要低于引物Tm值5摄氏度左右，若一对引物的Tm差值过大，那么会直接造成PCR失败或者扩增效率下降。

5、通常情况下，G+C含量为40％-60％

引物的解链温度会受到引物的碱基组成的影响。若G+C含量过高，那么解链温度高，容易和非特异性序列杂交，使得非特异性扩增条带出现。若G+C含量过低，那么解链温度低，容易使得引物从模板上解离。

6.通常情况下，引物的长度为18-30碱基

解链温度和反应的特异性与引物长度成正相关。若引物过长，则会使得引物二级结构以及引物二聚体产生；若引物过短，则会降低扩增的特异性。

7.对容易形成二级结构的模板序列区域避开

二级结构会使得PCR和引物与模板杂交变得更加困难，所以，对这种序列区域要尽可能避开。可以使用相关软件对mRNA的稳定二级结构进行预测。

8.引物的特异性要足够

若特异的DNA序列需要从基因组等比较复杂的模板中被扩增，那么需要对目的DNA序列的保守性进行考虑，对于所选引物设计区域序列的非特异性要尽量避免。