real time pcr介绍

Real-Time PCR 技术，又叫做实时定量荧光PCR，指的是将荧光基团加入到PCR反应体系中，通过荧光信号累积对整个PCR进程实时监测，Z后通过Ct值对模板进行相对定量或通过标准曲线对未知模板进行总量分析。

技术原理

定量PCR已经从以凝胶为基础的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术。实时荧光定量PCR技术不但使PCR从定性到定量的飞跃得以实现，而且其比常规PCR有更强的特异性，对污染问题可以更加有效的解决和有更高的自动化程度。在PCR指数扩增时，

特异性产物的量利用连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定，并且以此对目的基因的初始量进行推断，没有必要取出PCR产物进行分离。作为一个非常有效的实验方法，实时定量PCR已经在分子生物学研究的各个领域得到广泛地应用。

常用方法

常用的方法有SYBR green（荧光染料掺入法） 和Taqman probe （探针法）两种。

荧光染料掺入法

介绍：

将过量SYBR荧光染料加进PCR反应体系中，SYBR荧光染料特异性渗入DNA双链后，发射荧光信号，而不渗入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而使荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步得到保证。

特点与适用性：

1.高通量大规模的定量PCR检测。

2.没有很高专一性要求的CR检测。

3.具有很高的灵敏度，若使用SYBR，则会使得荧光效果增强到1000倍以上。

4.具有良好的通性，不需要设计探针，方法简单，节约时间，成本低。

5.方法通用性好，普遍应用于国内外科研领域。

探针法

介绍：

在PCR扩增时，在将一对引物加入的同时再将一个特异性的荧光探针加入，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，淬灭基团吸收报告基团发射的荧光信号。PCR扩增时，aq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，分离了报告荧光基团和淬灭荧光基团，所以，荧光信号可以被荧光监测系统接收到，就是每有一条DNA链扩增，就会形成一个荧光分子，从而使得荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步实现。

特点与适用性：

1.存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。

2.在人类传染病的诊断和病原定量、生物制品的鉴定、畜禽产品的检验检疫以及动物病原体基因的检测方面得到广泛地应用。

3.适应性高，可靠性强，稳定的实验结果，具有较好的重复性和更高的特异性。

4.对于扩增序列专一的体系的检测很适用。

5.对于样品中靶基因含量过低的定量PCR检测很适用。

6.如果靶基因特异序列较短的话，那么不管对引物设计条件怎么优化都不能解决。