荧光定量PCR的注意事项

将荧光基团加入到PCR反应体系中，通过不断累积荧光信号从而使对PCR全程的实时监测实现，再根据标准曲线定量分析未知模板的方法，即是荧光定量PCR技术。在实时荧光定量PCR中，实时检测全程PCR扩增过程，按照反应时间和荧光信号的变化能够将一条曲线绘制成。

注意事项

1.操作规范

需要规范样品核酸提取和实时荧光扩增时的操作，避免样品交叉污染， 酶被降解，出现假阳性的情况。

（1）根据试验的分区严格操作，按照提取区、扩增区、检测区单方向流动，不能够逆向流动物品、样品和试剂。 

（2）在对多份样品进行操作的时候，制备反应混合液，首先混合好荧光PCR反应液、荧光探针和酶。之后在每个PCR管中进行分装，如此不仅会使操作次数减少，而且能够使污染避免，还能够使反应的精确度增加。

（3）在对样品和蛋白酶k添加的过程中，要对避免酶的降解和样品的交叉污染尤其留心。

（4）在操作的时候，需要将阴性及阳性对照设立，能够对荧光PCR反应的准确性和可信性进行验证。

（5）使用的离心管、枪头和PCR 管需要确保没有污染，或者将它们进行高压灭菌。

（6）在完成核酸的提取之后应当立刻进行仪器的扩增，不能够在室温环境下过长时间放置提取的核酸，空气中的酶能够轻易的将其降解，其可以在－70 ℃冰箱内长期保存，在 －20 ℃冰箱内短期保存。

（7）因为产物气溶胶或标本 DNA 会很容易对移液器造成污染，所以需要使用可高压处理的移液器。

2.温度设置

在对荧光 PCR 程序进行设置的时候，应当需对程序中的目标温度、恒温时间和循环次数等参数仔细的核对，PCR 检测结果会受到不正确的参数设置的影响。延伸过程中，需要对荧光信号的读取收集进行设置。如果不对收集荧光进行设置，那么试验数据将无法保存，检测结果将没有办法判定，从而导致试验失败。

3.仪器摆放

放置实时荧光定量 PCR 仪的台面应当平稳，离水池较远，少灰，干燥，不能有强光直射，室内应当没有腐蚀性气体合良好的通风。