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荧光定量PCR的注意事项

将荧光基团加入到PCR反应体系中,通过不断累积荧光信号从而使对PCR全程的实时监测实现,再根据标准曲线定量分析未知模板的方法,即是荧光定量PCR技术。在实时荧光定量PCR中,实时检测全程PCR扩增过程,按照反应时间和荧光信号的变化能够将一条曲线绘制成。


注意事项

1.操作规范

需要规范样品核酸提取和实时荧光扩增时的操作,避免样品交叉污染, 酶被降解,出现假阳性的情况。

(1)根据试验的分区严格操作,按照提取区、扩增区、检测区单方向流动,不能够逆向流动物品、样品和试剂。 

(2)在对多份样品进行操作的时候,制备反应混合液,首先混合好荧光PCR反应液、荧光探针和酶。之后在每个PCR管中进行分装,如此不仅会使操作次数减少,而且能够使污染避免,还能够使反应的精确度增加。


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(3)在对样品和蛋白酶k添加的过程中,要对避免酶的降解和样品的交叉污染尤其留心。

(4)在操作的时候,需要将阴性及阳性对照设立,能够对荧光PCR反应的准确性和可信性进行验证。

(5)使用的离心管、枪头和PCR 管需要确保没有污染,或者将它们进行高压灭菌。

(6)在完成核酸的提取之后应当立刻进行仪器的扩增,不能够在室温环境下过长时间放置提取的核酸,空气中的酶能够轻易的将其降解,其可以在-70 ℃冰箱内长期保存,在 -20 ℃冰箱内短期保存。

(7)因为产物气溶胶或标本 DNA 会很容易对移液器造成污染,所以需要使用可高压处理的移液器。


2.温度设置

在对荧光 PCR 程序进行设置的时候,应当需对程序中的目标温度、恒温时间和循环次数等参数仔细的核对,PCR 检测结果会受到不正确的参数设置的影响。延伸过程中,需要对荧光信号的读取收集进行设置。如果不对收集荧光进行设置,那么试验数据将无法保存,检测结果将没有办法判定,从而导致试验失败。


3.仪器摆放

放置实时荧光定量 PCR 仪的台面应当平稳,离水池较远,少灰,干燥,不能有强光直射,室内应当没有腐蚀性气体合良好的通风。


2019-07-11 17:57:14 浏览次数:206次
热门标签: 荧光定量PCR检测方法