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蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛,是一项重要的操作技术。 一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质,一些含量十分丰富,一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质,必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。
分类
亲和层析法包括特异性配体亲和层析法以及通用性配体亲和层析法。比较这两种亲和层析法。特异性配体亲和层析法通常将复杂的生命大分子物质作为配体,它的结合力比较大河吸附选择性比较强。而通用性配体亲和层析法通常将简单的小分子物质作为配体,因此,它具有低廉的成本,吸附容量比较高,通过对吸附和脱附条件的改善能够使得层析的分辨率提高。
原理
亲和层析的原理类似于酶-底物,激素-受体与抗原-抗体等特异性反应的机理。有一定的亲和力在每对反应物之间。与在酶与底物的反应中,只有特异的底物才可以结合一定的酶,使复合物产生相同。在亲和层析中,只有特异的配体才可以和一定的生命大分子有亲和力,并且使复合物产生。亲和层析配体呈固相,而酶与底物的反应底物呈液相是它们的不同点。
实质
事实上,亲和层析是在含有活化基团的基质M上以共价键的方式固化具有识别能力的配体L,将固相载体制作成功而固化后的配体束缚特异物质的能力依然保持。所以当在小层析柱装入固相载体,使得欲分离的样品在该柱经过。此时,样品中对配体有亲和力的物质S就能够通过结构互补效应、范德瓦尔力与静电引力等作用在固相载体上吸附着,而起始缓冲液则会洗涤出无亲和力或非特异吸附的物质,并且使得diyi个层析峰形成。
之后,为了从固相载体上解离下物质S并且使第M个层析峰形成,对起始缓冲液的pH值进行适当的改变、或者将YZ剂等因子加入、或者使得离子强度增加。显而易见,这些方法能够有效地分离开杂质和有效成分,若在样品液中,与固相载体具有亲和力的物质存在两个以上,则洗脱采用选择性缓冲液,也可以分离开它们。再生处理用过的固相载体之后,能够重复的使用。
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