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DNA提取常见问题(一)

核酸提取仪是应用配套的核酸提取试剂来使得样本核酸提取工作自动完成的仪器。其在环境微生物检测、食品安全检测、输血安全、法医学鉴定、疾病控制中心、临床疾病诊断、生物学研究以及畜牧业等多种领域得到广泛地应用。下面就让小编带你了解一下DNA提取的常见问题。


常见问题

1.加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再要用SDS与KAc来处理?

加进去的RNase本身是一种蛋白质,必须将其去除以便纯化DNA,将SDS加入能够使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀,再将KAc加入,能够使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物,使沉淀更加完全。也能够使用饱和酚、氯仿抽提再沉淀,将RNase去除。在溶液中,NaAc使用KAc代替,效果同样比较好。


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2.为什么在保存或抽提DNA过程中,一般采用TE缓冲液?

在基因操作实验中,保持DNA的稳定性以及不会干扰缓冲液成分是选择缓冲液的主要原则。尽管磷酸盐缓冲系统(pKa=7.2)和硼酸系统(pKa=9.24)等均符合细胞内环境的生理范围(pH),,能够用作NA的保存液,然而在转化实验时,磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀。在DNA反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数量有着不同的要求,有的则要求低盐浓度,有的要求高离子浓度,采用Tris-HCl(pKa=8.0)的缓冲系统,由于对于金属离子的干扰作用不存在,ris-HCl系统大都用于DNA的提取或保存,而TE缓冲液中的EDTA能够使得DNA的活性更加的稳定。


3.为什么用无水乙醇沉淀DNA?

实验中最常用的沉淀DNA的方法为使用无水乙醇来对DNA进行沉淀。能够和水以任意比相混溶相混溶是乙醇的优点,与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,所以其是理想的沉淀剂。DNA以水合状态稳定存在即是DNA溶液,当将乙醇加入时,DNA周围的水分子会被乙醇夺去,导致DNA失水而使聚合变得容易。通常实验中,是将2倍体积的无水乙醇加入与DNA相混合,乙醇含量的最终占比大约为67%。由于和95%乙醇相比较,无水乙醇的价格要昂贵的多,然而加95%的乙醇会增大总体积,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,所以也增加了DNA损失,特别多次使用乙醇沉淀时,就会对收得率产生影响。最后的沉淀步骤要使用无水乙醇,初次沉淀DNA时使用95%乙醇为折中的做法。也能够用0.6倍体积的异丙醇对DNA选择性沉淀。通常在室温下放置15-30分钟就行。


4.在用乙醇沉淀DNA时,为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1~0.25mol/L?

在溶液pH大约为8时,DNA分子是带负电荷的,将一定浓度的NaAc或NaCl加入,Na+会对DNA分子上的负电荷进行中和,从而使少DNA分子之间的同性电荷相斥力减少,使互相聚合形成DNA钠盐沉淀变得容易。当加入浓度过低的盐溶液时,只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合,如此会导致DNA沉淀不完全,,当加入的盐溶液浓度太高时,也没有很好的效果。在沉淀的DNA中,因为存在过多的盐杂质,对DNA的酶切等反应产生影响,必须要进行洗涤或重沉淀。


2019-08-13 17:44:38 浏览次数:55次