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DNA提取过程中细胞裂解原理和方法

核酸提取仪是应用配套的核酸提取试剂来使得样本核酸提取工作自动完成的仪器。其在环境微生物检测、食品安全检测、输血安全、法医学鉴定、疾病控制中心、临床疾病诊断、生物学研究以及畜牧业等多种领域得到广泛地应用。下面就让小编带你了解一下DNA提取过程中细胞裂解原理和方法。


裂解原理

细胞裂解对于核酸提取是非常的重要的,去污剂(如SDS、TritonX-100、NP-40、Tween20等)和盐(如Tris、EDTA、NaCl等)一般都包含在经典的裂解液中。盐不仅起到提供一个合适的裂解环境(如Tris)的作用,还包括对样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏(如EDTA)的抑制,使核酸结构的稳定(如NaCl)得以维持等的作用。去污剂通过使蛋白质变性,对膜结构进行破坏以及与核酸相连接的蛋白质将解开,从而使核酸在裂解体系中游离得以实现。裂解体系中还可能将蛋白酶加入其中,利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段,对分开核酸与蛋白质起到促进作用。同时,也为后面的纯化操作以及获得更纯的核酸提供了方便,裂解也有直接对高浓度的蛋白质变性剂(如GIT、GuHCl等)进行使用的,该方法虽然不是基因组DNA抽提的主流,却是RNA抽提的主流。


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细菌细胞破碎方法有以下几种:

1.反复冻融法

在-20度以下冰冻细胞,在室温下融解,反复多次,因为冰粒在细胞内形成和增高了剩余细胞液的盐浓度而造成溶胀,导致细胞结构破碎。


2.酶解法

将溶菌酶或蜗牛酶、蛋白酶K等加入,均能够导致细胞壁破碎,释放出核酸。蛋白酶还可以对与核酸结合的蛋白质进行降解,对核酸的分离起到了促进作用。其中溶菌酶可以对细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1,4)键水解起到催化作用。其存在去污剂(0.5%SDS或1%TritonX-100)和EDTA、尿素(1~4mol/L)以及温度65℃的情况下依然有酶活性保留,此对高分子量核酸的提取效率的提高非常的有利。在实际工作中,经常将酶作用、机械作用、化学作用联合起来使用。按照细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来决定具体选择哪种或哪几种方法。


3.机械方法:

匀浆法、研磨法、超声波处理法,关于超声波处理法,需要将超声时间和间隙时间设定好,通常超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间。


4.化学试剂法

使用含SDS或CTAB的溶液来对细胞进行处理,在一定的pH环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相,由加入的强碱(NaOH)或缓冲液(TE、STE等)提供了pH环境,表面活性剂或强离子剂能够导致细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀。缓冲液中的一些金属离子螯合剂(EDTA等)能够对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+、Ca2+进行螯合,从而使核酸酶的活性得到抑制,对核酸进行保护,使其不会被降解。


2019-08-13 17:57:47 浏览次数:97次

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