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免疫印迹法 (Western blotting) 是一种结合了免疫化学分析和技术高分辨率凝胶电泳的杂交技术。免疫印迹法是对蛋白质特性、表达与分布进行检测Z常用的一种方法,例如病毒的抗体或抗原检测、多肽分子的质量测定与组织抗原的定性定量检测。免疫印迹法具有很强的特异性,很高的敏感度以及很大的分析容量。免疫印迹法(immunoblotting test,IBT)也叫做酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB),由于其类似于Southern早先建立的检测核酸的印迹方法 Southern blot ,因此也被叫做Western-blot。
阶段
免疫印迹法的进行包括三个阶段
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE):
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)为diyi个阶段。经过SDS的处理,抗原等蛋白样品带有负电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中,由阴极向阳极泳动,分子量与泳动速度成反比,肉眼不能观察出该阶段分离的效果(电泳区带只有染色后才能被显示出来)。
电转移:
第二阶段为电转移。往硝酸纤维素膜上转移在凝胶中已经分离的条带,选择大电流(1~2A)以及低电压(100V),通电45分钟就能够完成转移。肉眼依然不能观察出该阶段分离的蛋白质条带。
酶免疫定位:
酶免疫定位为第三阶段。依次将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)特异性抗体和酶标第二抗体作用后,将可以使得不溶性显色物形成的酶反应底物,使区带染色。4-氯-1-萘酚(呈蓝紫色)和3,3'-二氨基联苯胺(呈棕色)为常用的HRP底物。能够清晰辨别阳性反应的条带,并且能够通过SDS-PAGE时加入的分子量标准,将各组分的分子量确定出。该方法是将ELISA法的高特异性和敏感性和SDS-PAGE的高分辨力相结合,分析手段非常有效,除了能够在分析抗原组分及其免疫活性方面得到广泛地应用,而且在疾病的诊断方面也能够使用。在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。抗原经电泳在硝酸纤维素膜上转移后,将膜切成小条,与显色底物制成的试剂盒和酶标抗体相结合,在实验室中为检测提供了方便。有无针对病毒的特异性抗体能够通过出现显色线条的位置判断出来。
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