DNA非同位素银染色法介绍

手工测序以及自动测序均属于DNA序列测定，手工测序可分为maxam-gilbert化学降解法与sanger双脱氧链终止法，事实上，目前dna序列分析的主流是自动测序。373型、377型、310型、3700和3100型等多种型号DNA测序仪均已经被美国pe abi公司生产出来了，在这几款DNA测序仪中，临床检测实验室使用Z多的一种型号要属310型。

非同位素银染色法

SILVER SEQUENCETM DNA测序系统为一种无放射性的序列分析系统，，对于凝胶中的条带的检测利用灵敏的银染方法来进行，相对于放射性或荧光法而言，一种成本更低，速度更快的替代方法为银染所提供，而且还能够在同一天内使测序结果得到。能够做到常规的放射性测序法无法做到的在结束电泳90分钟就能够对序列进行读取。除此以外，未修饰的5'OH寡聚核苷酸被SILVER SEQUENCETM系统作为引物，使得特殊修饰寡聚核苷酸的花费减少了。该系统不但放射性方法中谨慎操作同位素不需要，而且荧光法或化学发光技术的昂贵试剂也不需要。除此以外序列条带的检测根据荧光法那样对机器进行使用也不需要。

引物延伸在每个循环的退火阶段起始，当温度较低时，坚固的二级结构区域可能会被聚合酶遇到，从而能够解离聚合酶。有同一相对位置的条带在四个电泳道中，由于这些因素，应当对尽可能高的退火温度进行使用。建议将95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式使用于有牢固二级结构的模板中。通常而言，引物越长，引物的GC含量越高，那么可以得到的信号就比较强，通过试验结果可知，50%的引物有>24mer的GC含量，那么能够使Z佳结果得到。

因为热循环装置为本系统采用，相比于常规的测序方法，好处如下：

1、 高温聚合酶反应使得DNA模板的二级结构减弱了，聚合酶穿过高度二级结构化的区域被允许了。

2、在每一个变性循环中，双链DNA（dsDNA）模板的碱变性及乙醇沉淀过能够由高温所替代，变性循环对因为线性dsDNA模板（如PCR反应产物）快速重退火所引起的问题的消除非常有帮助。

3、本方法对模板DNA进行线性扩增，使得足够的产物产生，从而使得银染技术可以对序列条带进行检测，需要0.03～2pmol模板DNA来进行测序反应，取决于模板种类。

在95℃的时候，Taq DNA聚合酶的热稳定性非常的强。一种Taq DNA聚合酶的修饰产品为本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶，有显著效果于双链DNA模板，准确性分厂高，产生的条带均一，并且有较低的背景。

被修饰的核苷酸混合物包含于SILVER SEQUENCETM系统中，由GC丰富区域所引起的条带压缩现象能够使用替代dGTP的7-去氮dGTP（7-deaza dGTP，或dITP）清除掉。

热循环测序中非常重要的因素就是退火温度，高退火温度能够使得模板二级结构减少，使得引物结合模板配对的严谨性提高。小片断PCR产物（<500bp）得到清楚的序列数据的能力会由于链重退火和模板二级结构而被限制。

21世纪di一个十年里，DNA测序与生物云计算、个性化分子诊断、基因芯片、人类基因组计划等等吸引无数眼球的热门词汇息息相关。在创意新天地里，生物技术和信息技术相互融合，相互作用，相互影响。

在业外人士眼里，DNA测序足以成为“一项新技术衍生出一个新行业”的典范，非常的高科技，国内外VC和PE视之为宠儿，其在相当短旳时间内得到了非常迅猛的发展。它十年后的发展蓝图还没有人能准确描绘出来，由此可见其的发展速度的快速。所有预测相对于日新月异的DNA测序技术来说均会显得保守。

DNA测序方法的飞速发展除了使人类的全基因组序列为我们所知晓，而且还使得我们充分掌握了小麦、水稻、家蚕以及很多细菌。此时，科学家们的新目标也就变成了对一段序列所代表的生物学意义的探明。用于编码基因仅仅只有1.5%存在于核苷酸组成的庞大序列中，除此以外，扮演调控基因表达的角色有少许，其中功能未知的“垃圾DNA”占绝大部分，这一发现是科学家通过分析人类基因组序列获得的。由表面可知，人与人之间有着缤纷复杂的不同之处，然而，深入到DNA水平上，却仅仅存在0.1%基因编码序列上的不同。大多数时候，人与人之间在一条序列上的差异只有一个核苷酸，科学家将这种现象命名为单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，简称SNPs）。