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手工测序以及自动测序均属于DNA序列测定,手工测序可分为maxam-gilbert化学降解法与sanger双脱氧链终止法,事实上,目前dna序列分析的主流是自动测序。373型、377型、310型、3700和3100型等多种型号DNA测序仪均已经被美国pe abi公司生产出来了,在这几款DNA测序仪中,临床检测实验室使用Z多的一种型号要属310型。
454焦磷酸法平台
边合成边测序为454焦磷酸法平台使用的技术,使Sanger法存在的宿主菌克隆问题得以避免,其为较早上市的循环微阵列法平台。
1、首先打断待测的目的DNA分子,使其成为300-800bp的片段,之后将一个磷酸基团加在DNA片段的 5′ 端,使其变成平端,将44 bp的A、B 两个衔接子分别加在两端,使得目的DNA 的样品文库组成,在生物素和链霉亲和素的作用下,其与含有过量链霉亲和素的磁珠特异性结合为将两个衔接子 A、B加上的目的。
2、在一个磁珠上固定目的 DNA 片段以后,在单个油水混合小滴(乳滴)里独立的扩增被包被的磁珠,而且不会受到其他的污染性或竞争性序列的影响,从而使平行扩增乳滴 PCR所有目的 DNA片段得以实现,经过富集之后,大约有107个克隆的DNA片段位于每一个磁珠上。
3、之后往PTP反应板中放入DNA片段进行之后的测序,有160多万个由光纤组成的孔位于PTP平板上,有化学发光反应所需的各种酶和底物在这160多万个由光纤组成的孔中。
4、开始进行测序的时候,按照 T、A、C、G 的顺序往 PTP 板中依次循环将放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基放入,每次只有一种碱基进入。若有碱基配对发生,就会有一个焦磷酸盐分子释放出来。
5、仪器配置的高灵敏度CCD对此反应释放出的光信号进行实时捕获,有一个碱基和测序模板进行配对,就会有一分子的光信号被捕获到,由此一一对应,就能够对待测模板的碱基序列进行准确、快速地确定。
从前将致病相关基因从数万个人类基因中筛选出来犹如大海捞针。为了对这个基因究竟在何处想方设法的定位,科学家需要对同一个家族的多位患者的标本进行获取。设计高通量药物,致病或抑病基因的鉴定、疾病易感人群的筛查甚至个性化YL由于具备了如今快速测序技术和SNPs这个强有力的工具而不再是需要向往的事。
在业内,DNA测序有着高贵的出身,其将碱基序列这一基因密码破解,融合了IT技术与基因组学,将生物信息学这一新兴学科开创和发展了出来。传统的生物学技术被以生物信息学为代表的基因技术彻底颠覆了,对生命科学未来发展潮流起到引ling作用,在YL健康、环境保护、新能源、新材料、现代农业等热门领域以它为代表的基因工程得到了广泛地应用。
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