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纯化对测序质量的影响

手工测序以及自动测序均属于DNA序列测定,手工测序可分为maxam-gilbert化学降解法与sanger双脱氧链终止法,事实上,目前dna序列分析的主流是自动测序。373型、377型、310型、3700和3100型等多种型号DNA测序仪均已经被美国pe abi公司生产出来了,在这几款DNA测序仪中,临床检测实验室使用最多的一种型号要属310型。


纯化对测序质量的影响

(1)荧光物质污染

现象:存在异常高的红色峰。

原因软件将红色的未知大分子荧光物质污染误认为红色峰。

方法:对胶引导块、针筒进行更换;对水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管依次进行更换。


(2)钉子峰

现象:有峰形锐利的尖峰四色并存突然拔起。

原因:有气泡、灰尘、尿素结晶存在于毛细管中,全反射激光。

方法:

使用纯化干净的样品;

当有尿素结晶存在于胶内的时候,留心不能将其往注射器内吸入。

保持检查窗口以及毛细管清洁。

先将样品离心然后再上样。

防止气泡在灌胶时产生。


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(3)有机物污染

现象:基线突然从高处下降。

原因:在毛细管中有有机物进入,使一定波长的荧光产生,将基线抬高。

方法:对胶引导块、针筒进行更换;对水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管依次进行更换。


(4)染色峰

特点:在序列的前100bp左右有残余的A、T、C、G4个BigDye染料峰,其对其他序列的可靠性不会产生影响。


(5)酒精峰

特点:在序列的200bp-300bp碱基之间有酒精峰,透明抬高图谱,其同样不会对其它序列的可靠性产生影响。


DNA测序方法的飞速发展除了使人类的全基因组序列为我们所知晓,而且还使得我们充分掌握了小麦、水稻、家蚕以及很多细菌。此时,科学家们的新目标也就变成了对一段序列所代表的生物学意义的探明。用于编码基因仅仅只有1.5%存在于核苷酸组成的庞大序列中,除此以外,扮演调控基因表达的角色有少许,其中功能未知的“垃圾DNA”占绝大部分,这一发现是科学家通过分析人类基因组序列获得的。由表面可知,人与人之间有着缤纷复杂的不同之处,然而,深入到DNA水平上,却仅仅存在0.1%基因编码序列上的不同。大多数时候,人与人之间在一条序列上的差异只有一个核苷酸,科学家将这种现象命名为单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,简称SNPs)。


2019-09-11 16:02:56 浏览次数:69次

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