DNA合成方法

在体外人对双链DNA分子合成的技术，即是基因合成，不同于寡核苷酸合成：寡核苷酸是单链的，大约100nt为其所可以合成的Z长片段。基因合成却是双链DNA分子合成，50bp-12 kb是可以合成的长度范围。

基因合成法合成目的基因的方法分为在体外人为地利用酶学方法或化学方法两类。

1、化学合成法

目的基因的合成方法使用化学法结合酶学法或化学法。1979年以来国外已有包括胰岛素基因，干扰素基因，以及乳糖操纵基因，启动子调节序列等近百种化学合成基因，近百种化学合成基因，先要对所要合成的基因的序列有所了解。能够按照需要来对基因中的一个或几个核苷酸任意增加、减少或变更的随意性是人工合成基因的优越性所在。

2、酶学合成法

将RNA作为模板，通过逆转录合成cDNA。此方法在真核结构基因的获得中Z常用。因为难以对RNA单一组分进行分仪，因此合成的cDNA分子通常不存，分离需要用到基因分子，这种方法获得全长的互补DNA分子不太容易，因此进一步剪切、拼接非常有必要。

合成原理

DNA通过固相亚磷酰胺三酯法合成，仪器自动完成整个合成过程,每个循环分为脱保护、活化、偶合、盖帽(封闭)、氧化五个步骤。

脱保护:

CPG所链核苷上的DMT保护基团用三lv乙酸(TCA)去除，使得5'羟基暴露，为下一步缩合提供便利。

活化:

混合单体与催化剂四唑，往合成柱内放入，3亚磷酸上二异丙胺基的N原子接收四唑转移的一个质子，四唑亲核进攻的离去基团是,质子化的氨，四唑取代二异丙酰胺，使得亚磷酰胺-四唑活性中间体形成。

耦合:

CPG所连接的核苷酸的5′羟基和亚磷酰胺-四唑中间体缩合将四唑缩合脱掉，使得一个碱基的核苷酸链形成并延长。

盖帽:

在后续的循环中，少量未反应(2%)的载体上的核苷酸链的5羟基会参加反应,使得少一个碱基的核苷酸链生成，所以应当在反应后进行封闭。

氧化:

由于耦合形成的三价亚磷酸酯键相当不稳定，因此需要使用氧化剂。按照这样的步骤循环,Z终会有一个全长DNA片段粗品被得到。从载体上用新鲜的浓氨水切割下粗品，氰乙基脱保护形成的盐离子和短片段和氨基脱保护采用适当的纯化方式去除。