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反转录PCR(Reverse Transcription,RT-PCR)又叫做逆转录PCR。将组织或细胞中的总RNA提取出来,模板使用其中的mRNA,利用逆转录酶,采用随机引物或Oligo(dT)反转录成cDNA,模板再使用cDNA进行PCR扩增来对基因表达进行检测,或者使目的基因获得。
介绍
特异性引物
引物使用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸是Z为特异的引发方法。如果两种特异性引物为PCR反应所使用,利用与mRNA 3’端Z靠近的配对引物作为第yi条链的合成的起始。用此类引物只会有所需要的cDNA产生,使得PCR扩增更为特异。
随机六聚体引物
当有可以使反转录酶终止的序列在特定mRNA时,从而使得对其全长序列进行复制很困难,全长mRNA的复制能够通过随机六聚体引物这一不特异的引物来进行。当使用该方法时,全部cDNA第yi链模板由体系中所有RNA分子所充当,在扩增过程中,所需要的特异性赋予给了PCR引物。rRNA一般作为用此引物合成的cDNA的96%的来源。
Oligo(dT)
为一种对mRNA特异的方法。由于3’端Poly(A )尾为绝大多数真核细胞mRNA所具有,当其配对Oligo(dT)的时候,只能够转录mRNA。因为在总RNA中,Poly(A )RNA只有1-4%的比例,所以和随机六聚体作为引物和得到的cDNA相比较,此种引物合成的cDNA得到更少的数量和更为简单。
1、嗜热微生物的热稳定性反转录酶:
在存在Mn2下,高温反转录RNA被允许,用来对RNA模板的二级结构进行消除。
2、MMLV反转录酶的RNase H-突变体:
和其它酶相比较,更大部分的RNA能够由此种酶被转换成cDNA,这一特性为从不易低温反转录、含二级结构的mRNA模板使较长cDNA合成所允许。
3、Money 鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶:
37℃是Z合适的作用温度,有着相对比较弱的RNA酶H活性,聚合酶活性比较强。
4、 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶:
42℃是Z合适的作用温度,RNA酶H活性和聚合酶活性都比较强。
应用
RNA检测的灵敏性由于RT-PCR提高了几个数量级,提供了一些可能性对于分析一些极为微量RNA样品。RNAGX转录系统的构建、cDNA探针的合成、目的基因的获取以及基因的转录产物的分析为该技术的应用
RT- PCR即逆转录PCR,是结合了cDNA的聚合酶链式扩增反应(PCR)和RNA的逆转录(RT)的技术。RT-PCR技术有着广泛的用途并且非常的灵敏。能够被用来对特定基因的cDNA序列直接克隆以及对细胞中RNA病毒的含量和细胞/组织中基因表达水平进行检测等。
11-09
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