流式实验设计的原则

流式细胞术为一种生物学技术，计数和分选悬浮于流体中的微小颗粒是它的主要用途。这种技术能够用来连续的多参数的分析流过光学或电子检测器的一个个细胞。流式细胞术（Flow CytoMetry，FCM）是通过检测标记的荧光信号使高速、逐一的定量分析和分选悬液中的单细胞或其他生物粒子得以实现的技术。

实验设计原则

1、将红细胞去除的方法

红细胞裂解法，有着简单的操作，比较快的速度，并且使原始标本的白细胞分布尽可能保持。建议在染色后溶血。若需要在染色前溶血，则应当确保：

a、溶血过程中不能改变抗原性。

b、彻底洗去溶血剂，没有影响到细胞和抗体结合的动力反应。

c、固定剂不包含在所用的溶血剂中，不然会对细胞活性及表面标记结果产生影响。密度梯度离心法，能够比较好的回收靶细胞，并且可能得到富集，同时将红细胞、碎片等去除。

2、抗体与细胞的比例

假设靶细胞数量在5*10的五次方-1*10的六次方之间通常为厂家推荐的抗体用量。一些标本拥有的细胞不足量，一些标本的细胞拥有过多的细胞数量，假阳性或假阴性结果通常可能是由正常浓度下的抗体相对过量或不足导致的。因此，每个实验室需要按照厂家推荐的方法来对细胞与抗体用量进行调整，从而使Z合适的细胞/抗体比例获得。

3、鉴定细胞活性

死细胞对许多抗体都有很强的非特异性染色，因此样本细胞活性检测非常重要，尤其是经过长时间运输和储存的样本。通常有三种检测的方法。

a.实时的流式检测

死细胞利用PI、7-AAD或EMA进行染色,这些染料不能够对活细胞进行染色。能够同时进行细胞表面标志和活性分析为这个方法的优势。尤其适用于高度坏死的样本。Z常用的是7-AAD，由于在488nm激发下，670nm左右为其Z大发射光，与FITC或PE进行多色标记非常适合。但是随着时间延长，在固定的细胞群体，会重新分配7-AAD，很难区分死活细胞。因此，EMA，对于染色并在固定后12小时以上分析的标本是Z好的选择。EMA与死细胞DNA稳定的共价结合使长时间固定后仍能很好地区分固定前的死活状态得以保证。

b.手工检测

对Trypanblue或其他细胞活性染料进行使用。

c、使用专门的仪器进行检测。

4、获取单细胞悬液

天然的单细胞悬液包括骨sui穿刺液和外周血。酶消化和机械分离为两种常用的活检组织的方法。不同的方法适用于不同的实验。关于需要进行膜抗原标记的，除了需要将足够多的单细胞悬液获得，而且还要使细胞结构的完整性和抗原性尽可能保证，机械法是比较好的选择。仅需要进行细胞周期或DNA倍体分析的，比较好的方法是在机械法的基础上加酶消化（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）。

5、选择抗凝剂

EDTA、ACD或肝素抗凝为外周血标本所采用的抗凝剂。若做白细胞计数和流式分析采用同一份血液标本，则使用EDTA抗凝。一般肝素抗凝不用于血小板分析的实验。肝素或EDTA抗凝通常为骨sui穿刺液的抗凝剂。由于相对大量的ACD会将pH改变，从而可能会对骨sui细胞活性产生影响，因此通常骨sui穿刺液的抗凝剂不推荐使用ACD。

6、保存样本

在理想的状态下，需要在采集后立即对样本进行处理和染色。对于只作胞内染色的样本，能够将细胞固定，为长期保存提供便利。在室温条件下，通常能够将ACD抗凝的外周血保存至72小时；在室温条件下，通常能够将EDTA抗凝的外周血和骨sui保存12-24小时；在室温条件下，通常能够将肝素抗凝的血和骨sui保存至48-72小时。然而“固定－染色”的方法是由要分析的抗原特性和染色方式决定的。