基因扩增仪的原理|分类|应用

　　基因扩增仪性能zhuo越，能满足不同工作环境的多种需求。可用作以聚合酶链式反应为特征的、以检测DNA/RNA为目的的各种病原体检测及基因分析。基因扩增仪广泛应用于分子生物学、医学、食品工业、司法科学、生物技术、环境科学、微生物学、临床诊断、流行病学、遗传学、基因芯片、基因检测、基因克隆、基因表达等领域。

　　1、基因扩增的基本要素

　　基因扩增的基本要素与DNA复制的基本要素是一致的。

　　①DNA模板：待拷贝的DNA称为模板，它可以是双链DNA也可是单链DNA，Z后扩增得到的产物是双链状态的。

　　②引物：是DNA复制的先锋，就象结晶过程中的晶核，引导DNA的合成。在PCR扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。

　　③DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)：是DNA复制的动力，在dNTP等底物存在时在引物的引导下沿着模板DNA合成互补的DNA链。

　　④缓冲液：提供DNA合成反应所需的pH，离子强度等环境。

　　⑤4种单核苷酸：dNTP，提供DNA合成原料。

　　2、基因扩增仪原理

　　基因扩增仪是利用PCR技术对特定基因做体外的大量合成，用于以检测DNA/RNA为目的的各种基因分析。

　　PCR反应一般设置20~40次循环，每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板。PCR的扩增效率很高，如果循环次数是30次，那么新生DNA片段理论上达到230拷贝(约为109个分子)。PCR反应每个循环的三个基本反应步骤如下：

　　①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA产物解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备;

　　②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

　　③引物的延伸：温度升到7

　　基因扩增就是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制，是目前常用的技术。根据DNA扩增的目的和检测的标准，可以将基因扩增仪分为普通基因扩增仪，梯度基因扩增仪，原位基因扩增仪，实时荧光定量基因扩增仪四类。

　　一般把一次PCR扩增扩增只能运行一个特定退火温度的基因扩增仪，叫传统基因扩增仪，也叫普通基因扩增仪。如果要做不同的退火温度需要多次运行。

　　普通基因扩增仪主要是做简单的，对目的基因退火温度的扩增。可用于科研研究，教学，医学临床，检验检疫等机构。

　　一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(通常12种温度梯度)的称之为梯度基因扩增仪。因为被扩增的不同的DNApian段其Z适合的退火温度不同，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的Z适合退火温度进行有效的扩增。

　　基因扩增仪主要用来研究未知DNA退火温度的扩增，这样既节约时间，也节约经费。在不设置梯度的情况下亦可当做普通基因扩增仪用。正真的梯度基因扩增仪，是每一排管都有精确的加热控温探头，2009年为止只有美国ABI公司可以做到。其他的基因扩增仪都是从两头的热传递来设计控温。目前，梯度基因扩增仪多应用于科研、教学机构。

　　原位基因扩增仪是用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪。如病原基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。可保持细胞或组织的完整性，使基因扩增反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置进行基因扩增。不但可以检测到靶DNA，还能标出靶序列在细胞内的位置。于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转变有着重大的实用价值。

　　实时荧光定量基因扩增仪是在普通基因扩增仪设计基础上，增加荧光信号激发和采集系统和计算机分析处理系统，形成了具有荧光定量PCR功能的仪器。其PC

　　基因扩增仪主要作用原理与基本计量仪器相似，对计量要素要求较高，一旦失控，基因扩增仪将不能正常工作，所以基因扩增仪也需要定期维护保养，依赖自然风降温的基因扩增仪尤需注意。

　　1、PCR反应的要求温度与实际分布的反应温度是不一致的，当检测发现各孔平均温度差偏离设置温度大于1～2℃时，可以运用温度修正法纠正基因扩增仪实际反应温度差。

　　2、基因扩增仪需要定期检测，根据制冷方式而定，一般半年至少检测一次。

　　3、一般情况如能采用温度修正法纠正基因扩增仪的温度时，不要轻易打开或调整仪器的电子控制部件，必要时要请专业人员修理或利用基因扩增仪电子线路详细图纸进行维修。

　　4、PCR反应过程的关键是升、降温过程的时间控制，要求越短越好，当基因扩增仪的降温过程超过60s，就应该检查基因扩增仪的制冷系统，对风冷制冷的基因扩增仪要较彻底地清理反应底座的灰尘;对其他制冷系统应检查相关的制冷部件。

　　5、注意基因扩增仪的使用环境条件和电源，严禁工作时打开机盖，机盖开关要轻，以防损坏盖锁。

　　6、定期用中性肥皂水清洗样品槽，严禁使用强碱、有机溶液和高浓度酒精擦洗基因扩增仪。

　　1、基因扩增仪的安置

　　基因扩增仪应安放在湿度较低、灰尘较少并远离水源和热源，无腐蚀性气体或强磁场干扰的地方。环境温度应控制在18~35℃之间。仪器之间应保持50cm 以上距离，降低基因扩增仪之间的影响。

　　2、样品台、热盖定期清洁

　　用95%乙醇配合棉签、无尘布等工具，清洁样品台。之后运行基因扩增仪，设定保持温度为50℃，约5~10min，让残余液体挥发去除。热盖也应该用酒精或纯水定期清洗，确保热盖清洁，温控性能良好。对于荧光定量基因扩增仪，清洁样品台和热盖的同时，要去除灰尘等杂物，保证光路清洁，降低信号干扰。

　　3、使用前预热

　　老款的基因扩增仪的性能比不上新款基因扩增仪，使用前需

　　基因扩增仪用于扩增特定的DNA片段，这种方法可在生物体外进行，被广泛地运用在医学和生物学的实验室。基因扩增仪是一种在实验室使用频率及使用时间非常高的仪器，因此故障率也是比较高的。

　　基因扩增仪的故障主要有以下几类：①制冷半导体故障;②温度传感器故障;③控制板故障;④电源板故障;⑤热盖故障;⑥软件故障;⑦其他故障。

　　1、制冷半导体故障

　　制冷半导体故障率与制冷半导体的质量、温度变化次数(循环次数)以及制冷片防水等都有关系。

　　制冷半导体是基因扩增仪的核心部件，基因扩增仪用的制冷半导体，都是工业级基因扩增仪专用的半导体片，主要是能耐大的温度变化。但这些制冷半导体的生产都是半手工的，也没有很好的办法来检测其耐用性。总之是有一定的故障率的。

　　制冷半导体的耐温度变化次数是与其材料及生产技术相关的。如陶瓷片切块、非硬性焊接等技术。好的制冷半导体生产商会提供温度变化次数实验数据。其性能随温度变化次数会下降。有的PCR仪具有温度变化次数计数的功能。

　　制冷片保持低温(如4度)时，冷面会凝集水。因此制冷半导体片需要防水，其周围环境也需要防水。防水做得不好，制冷半导体片进水，其寿命会大大减少。我国南方的基因扩增仪用户常发生4度过夜后制冷片故障。因此，不需要4度过夜的话，Z好别4度过夜。

　　2、温度传感器故障

　　基因扩增仪用的温度传感器是大致有三类，即热电阻型、热电偶型和半导体型。热电阻型、热电偶型用得多，故障率较低，而半导体型的因为内含电路，在基因扩增仪中使用时故障率较高(当然它有其他的优点)。

　　3、控制板故障

　　控制板是基因扩增仪的指挥ZX，其比较容易受到外部因素的影响而出现故障，如灰尘过多引起控制板温度过高、湿度过大引起电路短路、串扰(从电源线来)及电磁幅射(无线)的干扰等。

　　4、电源板故障

　　电源板故障主要来自于电源的品质不好(不同级别的电源价格差别较大)

　　基因扩增仪因操作方便、运行速度快、实验结果准确，受到越来越多的分子生物学研究者青睐。面对各种不同性能的基因扩增仪，又该如何选择呢?

　　误区一：仪器通道越多越好

　　随着基因扩增技术的成熟运用，多重扩增越来越热闹，基因扩增仪也不能幸免。从Z初ABI公司推出的单通道基因扩增仪发展到如今各个厂家都推出4通道、5通道甚至6通道基因扩增仪，眼花缭乱的选择让人无所适从，就有人一不小心走进了“通道越多越好”的误区。

　　在使用有些厂家5通道的基因扩增仪时，为了确保实验结果的精确性和准确性都要在实验中使用ROX或专用的Referencedye，这些荧光染料都必须单独使用一个检测通道。这样以来，真正能检测多重PCR荧光信号的有效通道只有4个，而且使用校正染料可能会增加后期的使用成本。

　　考虑多重基因扩增仪的通道数的时候也应该从实验室实际情况出发，多重基因扩增仪并非人人适用、人人可用，因为它使实验复杂化了。

　　误区二：基因扩增仪无需梯度功能

　　对于使用染料法的定量PCR反应，虽然有各种各样的PCR引物设计软件或者经验公式计算熔解温度(Tm值)，但运用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差异会很大。引物的熔解温度决定了退火温度。而且模版中碱基的组合千变万化，对于特殊片断，经验公式得到的数据不一定能得出准确的结果，退火温度细微的差异对结果都可能产生决定性的影响，因而“摸条件”一度是让人很头疼的问题。

　　梯度基因扩增仪的出现部分解决了一些问题，在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在指定范围内按照梯度变化，根据结果，一步就可以摸索出Z适合的反应条件。使用有梯度功能的基因扩增仪可以一次完成以往多次实验才能完成的优化过程，简化了摸索PCR反应条件的繁琐实验，既节省实验时间提GX率，又节省实验成本。

　　1、基因扩增仪的检测通量

　　在购买定量基因扩增仪的时候，要根据实验室

　　荧光定量基因扩增仪的PCR扩增原理和普通基因扩增仪扩增原理相同，只是PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。该仪器主要用于医学临床检测，生物医药研发，食品行业，科研院校等机构。

　　标记有荧光素的TaqMan探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的TaqMan探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得CT值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

　　荧光定量基因扩增仪比普通基因扩增仪多了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统。

　　荧光定量基因扩增仪主要是用来定量分析和确定基因转录水平的，而普通基因扩增仪是做定性分析和扩增基因片段，荧光定量基因扩增仪可以做普通基因扩增仪的工作，而反之就不行了，况且这样代价太大了，一般的实验室都不允许这样做的。总之两者的功能不能互相取代。

　　普通基因扩增仪只能够定性地分析是否存在目标片段。但是价格要低很多，而且运行成本也要低很多。不过不能直接得到扩增结果，还需要做电泳检测。实际中检测遗传疾病，品种分子标记筛选，甚至亲自鉴定等都可以由普通基因扩增仪完成。

　　但是，某些需要定量的实验就必须用到实时定量基因扩增仪了。比如检测某些病原物的数量(血液乙肝病毒复制程度)，特定基因的表达量(比如结合反转录做的RNA定量分析)，某些基因在染色体组中拷贝数等等。荧光定量基因扩增仪一般不需要对扩增产物进行电泳分析，操作相对简单些，但是耗材实在是贵。

　　简单来说，普通基因扩增仪只能扩增，不能检测，便宜。荧光定量基因扩