荧光分光光度计功能原理

荧光分光光度计能够用于摸清分子的成键和结构情况的实验，那么荧光分光光度计究竟内部是什么样的才能让其做到这些呢？

由光源发出的光经激发单色器变为单色光，照射在荧光池中的被测样品上产生荧光；物质产生的荧光被发射单色器色散为单色光，经光电倍增管转化为相应的电信号，再经放大器放大反馈到A／D转换单元，模拟电信号即转换成相应的数值，Z后经显示器或打印机记录被测样品的谱图，此时记录的谱图即为发射光谱(emissionspectrum)，又称为荧光光谱。这就是荧光分光光度计的基本工作过程。

荧光分光光度计的基本组成结构包括：激发光源、单色器、样品室、检测器、显示系统。

1、激发光源

光源提供激发样品的激发光，常见的激发光源有高压氙灯、高压汞蒸气灯、激光器、闪光灯等。高压氙灯能发射出强度较大的连续光谱，且在300～400nm范围内强度几乎相等，成为目前应用Z多的连续光源。高压氙灯的外壳为石英玻璃，内部充压力为5倍标准大气压的氙气，工作时压力可达到20倍标准大气压。以激光器作光源时，激发光强度大且单色性好，能极大地提高荧光分析的灵敏度。以激光器作为光源的高性能荧光仪可实现单分子检测，但存在激发光一般为单波长，不能调整入射光的能量，且价格昂贵，使用上受限制的缺点。此外，目前商品仪器中应用较多的闪光灯有氢灯、氮灯、脉冲激光灯等类型。

2、单色器

单色器用来分离出所需要的单色光。早期的荧光计是以滤光片来分离单色光，现在荧光分光光度计中应用Z广的是光栅单色器。一般地，荧光分光光度计上装有两个单色器，激发单色器和发射单色器。置于光源和样品室之间的为激发单色器，筛选出特定的激发光谱。置于样品室和检测器之间的为发射单色器，筛选出特定的发射光谱。单色器上有进、出光两个狭缝，增大狭缝宽度则信号强度增强，减小狭缝宽度则分辨率增大。单色器的色散能力与杂散光水平是两个重要的性能指标

荧光分光光度计能够对经光源激发后产生荧光的物质或经化学处理后产生荧光的物质成份分析，可应用于生物化学、生物医学、环境化工等部门，可以说是有很重要的用途。

荧光分光光度计能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数，从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的测定， 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化， 从而阐明分子结构与功能之间的关系。

荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190~650nm，发射波长扫描范围200~800nm。可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。

荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简单等优点，可对经光源激发后能产生荧光的物质或惊化学处理后产生荧光的物质进行定量分析，被广泛应用于食品检测、水质分析、生命科学、药物分析和药理学、有机化学和无机化学等领域。

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激发光谱，就是反映物质受到激发以后的情况，反映出该物质对于外来激发光的响应，反映其自身辐射波长随激发波长的变化关系。激发光谱有重要的应用价值，例如日光灯灯管中水银蒸气发出的紫外线能量的90%集中在254nm,就得选择激发光谱峰值在此附近的荧光粉。

在激发光谱中，横坐标的波长是指激发光的波长；（激发光谱是反映某物质在不同波长光激发下的发光情况的，纵坐标值越高，说明发光越强，能量也越高）。

量子产率是指光化学反应中光量子的利用率。一个光化学反应的量子产率可以定义为每吸收一个量子所产生的反应物的分子数，这通常是对于特定的波长而言，即量子产率=（生成产物的分子数）/（吸收的量子数）

定义为进行光化学反应的光子与吸收总光子数之比。符号为ψ，Y。积分量子产率为Ф进行光化学反应的光子数/吸收光子数。对于光化学反应，ψ=反应物消耗(或产物产生)的数量/吸收光子数量。微分量子产率为φ=(d[x]