荧光显微镜的原理|类型|用途

　　荧光显微镜是利用特定波长的光，照射被检物体产生荧光进行镜检的光学观测仪器，已有100多年历史。荧光显微镜是在复式显微镜上安装荧光装置集合而成，荧光装置包括荧光光源、激发光光路、激发/发射滤光片组件等器件。

　　荧光显微镜是医院科研、病理、检验等部门常用的医用光学仪器之一。因为普通的显微镜是在明亮的背景上观察暗物，而荧光显微镜是在暗背景下观察彩色的图像，因此它比普通的显微镜分辨力提高100倍，可以观察到普通显微镜看不到的细节。但是它的调整，校正难度较高，只要解决了荧光显微镜的问题，其它显微镜问题就迎刃而解。

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　　下图是荧光显微镜的光学系统图。由汞灯发出的各种谱线的光线，经激发滤光片后只让某一种波长的紫外光线通过，如波长为404.7nm蓝紫光，经反光镜后，激发样品产生荧光。激发滤光片将其他波长的光线滤掉，并使样品激发荧光，所以称其为激发滤光片。通常，激发产生的荧光波长比激发样品的光的波长大得多，是可见光。这样产生的荧光和透过样品的一部分激发光(紫外光)，经物镜成像后，人眼即可用目镜观察荧光图像。为了防止紫外光进入目镜视场，降低图像衬度和损伤人眼，放置了一块截止滤光片，它只让某一部分波长的谱线通过，如只让500～750nm的可见光通过，而不让500nm以下的光通过。

　　从图中可以看出，光源是荧光显微镜主要组成部分，荧光显微镜都采用200W的超高压汞灯作光源。它是由石英玻璃制作，中间呈球形，内充有一定量的汞，工作时在两极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约5～15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子在不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫光，足以激发各类荧光物质，因此被荧

　　荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具，由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。荧光显微镜利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。

　　一、光源：

　　荧光显微镜多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。

　　超高压汞灯在使用初期不需高电压即可引燃，使用一些时间后，则需要高压启动(约为15000V)，启动后，维持工作电压一般为50～60V，工作电流约4A左右。200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h，开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。

　　因此，使用荧光显微镜时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中，其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15min。由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因此灯泡必须置灯室中方可点燃，以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作者受伤。

　　二、滤色系统：

　　滤色系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤板和压制滤板组成。滤板型号，各厂家名称常不统一。滤板一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后面字母代表玻璃，数字代表型号特点。

　　1、激发滤板：根据光源和荧光色素的特点，提供一定波长范围的激发光。

　　紫外光激发滤板：此滤板可使400nm以下的紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。

　　荧光显微镜是光学显微镜的一种，是免疫荧光细胞化学的基本工具。以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后观察物体的形状及其所在位置。用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。

　　自从1590年詹森父子发明显微镜以来，已有400多年的历史。显微镜的发展一直是以提高图像的对比度和分辨力为主要目标。

　　荧光显微镜是以紫外光或蓝紫单色光激发标本来产生荧光，因为紫外光不可见，故由标本发出的荧光与背景反差很大，即荧光显微镜通常在黑暗的背景下观察彩色的图像;而普通显微镜是在明亮的背景下观察较暗的样品。这样荧光显微镜的对比度比普通显微镜提高约100倍，因此可观察到普通显微镜下看不到的结构细节。荧光显微镜具有对比度高这个突出的优点，得到了广泛的应用。

　　透射式荧光显微镜：

　　下图(a)是透射式荧光显微镜的原理图。由汞灯发出的各种谱线的光线，经激发滤光片后只让某一种波长的紫外光线通过，如波长为404.7nm蓝紫光，经反光镜后，激发样品产生荧光。这个滤光片将其它波长的光线滤掉，并使样品激发荧光，所以称激发滤光片。

　　通常，荧光波长比激发样品的光的波长大得多，是可见光。这样产生的荧光和透过样品的一部分激发光(紫外光)，经物镜成像后，人眼即可用目镜观察荧光图像。为了防止紫外光进人目镜视场，降低图像材度和损伤人眼，安放了一块截止滤光片，它只让某一部分波长的谱线通过，如只让500～750nm的可见光通过，而不让500nm以下的光通过，所以称为截止滤光片。

　　反射式荧光显微镜：

　　上图(b)是反射式荧光显微镜的原理图。反射式荧光显微镜和透射式荧光显微镜的原理类同。

　　反射式荧光显微镜有下列优点：

　　①光能的利用率高。在反射式荧光显微镜中，激发光直接照射在标本的观察表面;而在透射式荧光显微镜中，激发光穿过具有一定厚度的标本后才抵达观察表面，能量被衰减

　　荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。

　　1、用窗帘遮蔽光线，关闭房间内的电灯，除去荧光显微镜的防尘罩，确保荧光显微镜灯室通风良好、无遮盖。装上汞灯灯箱，并转动灯箱卡圈上的拨杆，将灯箱与镜臂连接。

　　2、将汞灯灯箱的电源插头插入荧光电源箱后的插座，再将荧光电源箱的插头插入220V外接电源。

　　3、打开荧光显微镜电源开关，电压表显示出电源电压，如电源电压波动不大于额定电压值的5%，即可按下启动开关点燃汞灯，如因天气太冷或电压不稳定等原因，一次启动未点燃汞灯，可以多按几次。待超高压汞灯弧光达到稳定状态并达到Zda发光效率，即可开始工作。

　　4、灯泡的调中：

　　①任选一块标本放在荧光显微镜载物台上。

　　②转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移出光路，转动滤色片组转换手轮，将紫光(V)或蓝光(B)或绿光(G)激发滤色片组转入光路，并将25荧光物镜转入光路。

　　③调节粗微调手轮，将标本像调焦清晰。

　　④前后推动垂直照明器右边的聚光镜调焦推杆，使视场光栏成像清晰，转动视场光栏拨杆将视场光栏收小，调节视场光栏调中螺钉使视场光栏居中，然后再将视场光栏开至Zda。

　　⑤转动镜臂上的聚光镜旋钮使聚光镜移入光路，前后调节灯箱上的聚光镜拨杆，使汞灯的弧光在视场内成像清晰。

　　⑥调整灯箱上的灯泡水平调节螺钉和垂直调节螺钉，使汞灯的弧光居中。

　　⑦调整反光镜水平调节螺钉和垂直调节螺钉，使光源的反射像与汞灯的弧光分开。

　　⑧转动聚光镜旋钮把聚光镜移出光路，此时视场照明均匀。

　　5、荧光观察：

　　①将荧光染色标本放到荧光显微镜载物台上。

　　②将10x平场物镜或25x荧光物镜转入光路，调节载物台纵横移动手轮，将标本移入光路。

　　③转动滤光片转换拨轮，将荧光染色标

　　荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜是基于荧光成像进行光度分析的光学测量仪器，广泛用于生命科学研究和临床实验室诊断等领域。

　　荧光显微镜比普通显微镜复杂，使用也比较麻烦，但只要注意下面几点，用户自行作些校准还是很容易的。

　　1、汞灯的校准

　　基于荧光显微镜的原理，决定了选用汞灯作为其光源。由于标本产生的荧光比较弱，为了得到较亮的图像，汞灯的校准至关重要。具体校准步骤如下：

　　①开启汞灯后，在荧光显微镜工作台上放一张白纸，并从物镜转换器中转出物镜，即转换器上出现的空孔位于光轴上，卸去转换器上保护盖(如无空孔，可卸掉一个低倍物镜，校准完毕后再旋上)。转动荧光显微镜主体内的滤光片座，选一个透过绿光的滤光片组，使反射照明有光通过物镜转换器孔，此时在白纸上可以看到汞灯照亮的光斑。如光斑太亮，可以插入中性滤光片，或带上太阳眼镜，以保护眼睛。

　　②转动聚光镜调焦旋手，使汞灯光弧在白纸上成像清晰。因汞灯室内装有一个球面反光镜，用来增加亮度，于是在白纸上看到两个光弧的像。旋转汞灯调节旋手和反光镜位置调节旋手，使两个光弧并立。再转动反光镜聚焦调节旋手，使两个光弧有接近相等的亮度。

　　③旋转汞灯调节旋手和反光镜位置调节旋手，使两个光弧重合。再调节聚光镜调焦旋手，得到放大和均匀的光弧像。这样汞灯校准工作就完成了。转入物镜后，根据物镜具体倍率，稍微调节一下聚光镜调焦旋手就可以了。

　　2、孔径光阑和视场光阑的校准

　　一般荧光显微镜均采用柯勒照明。所谓柯勒照明是一种能够得到图像Zda对比和Zda分辨的折中方法。这时，灯丝成像在孔径光阑上，一般也成像在物镜Z后一片镜框上。孔径光阑是限制光源大小的光阑，而视场光阑是限制人眼在目镜里看到视野大小的光阑。只有在正确校准柯勒照明的条件下，荧光显微镜才能获得它的Z佳光学性

　　倒置荧光显微镜是近代发展起来的新式荧光显微镜所属光学仪器的一种，特点是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。

　　倒置荧光显微镜由荧光附件与倒置显微镜有机结合构成的，主要用于细胞等活体组织的荧光、相差观察。

　　倒置显微镜是为了适应生物学、医学等领域中的组织培养、细胞离体培养、浮游生物、环境保护、食品检验等显微观察。由于这些活体被检物体均放置在培养皿(或培养瓶)中，这样就要求倒置显微镜的物镜和聚光镜的工作距离很长，能直接对培养皿中的被检物体进行显微观察和研究。因此，物镜、聚光镜和光源的位置都颠倒过来，故称为“倒置显微镜”。

　　倒置显微镜多用于无色透明的活体观察，在倒置显微镜的基础上添加一套荧光附件：激光激发块，荧光光源，荧光照明器，激发块切换装置，即可进行倒置荧光观察。

　　倒置荧光显微镜是近代发展起来的新式荧光显微镜所属光学仪器的一种，是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器，它与光轴呈45°角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片/双色束分离器/阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。

　　倒置荧光显微镜适用于对活体细胞和组织、流质、沉淀物等进行显微研究，是生物学，细胞学，肿瘤学，遗传学，免疫学等研究工作的理想仪器。可供科研、高校、YL、防疫和农牧等部门使用。倒置荧光显微镜是由倒置显微镜和落射荧光显微镜组成。仪器配有长工作距离平场消色差物镜、大视野目镜、双目观察，倒置显微镜还配有特长或超长工作距