自动微波增强合成带有O-连多糖的糖肽

摘要

使用微波增强多肽固相合成（SPPS）可以快速合成含有O-连多糖的糖肽，并具有良好的纯度。WbwA1（一种唾液酸糖基转移酶）的肽底物的使用Liberty BlueTM制备，以68% 的纯度在3 小时10分钟内完成。使用Liberty PRIMETM在1小时8分钟内合成了与TUS 核定位序列3缀合的APF（抗增殖因子）2类似物，纯度为73%。

介绍

糖基化是一种重要的翻译后和共翻译修饰，涉及蛋白质或肽与单糖、二糖或寡糖的共价修饰4。糖蛋白具有多种生物学功能，从结构蛋白和激素（如胶原蛋白和促甲状腺激素）到酶和蛋白质 参与调节免疫反应（如各种磷酸酶和抗体）5。随着糖基化的关键作用被进一步阐明，对糖肽化学合成的兴趣继续稳步增长。SPPS可以使用Fmoc保护的Ser或Thr制备含有O-连糖基化氨基酸的肽（图1）。将微波能量应用到含有O-连多糖的糖肽的合成中，可以实现更有效的偶联，从而缩短合成时间并提高纯度(CarboMAXTM)6 。

图 1 ：Fmoc-(S)-Ser(GlcNAc(Ac)3-β-D)-OH (左) 

Fmoc-(S)- Thr(GlcNAc(Ac)3-β-D)-OH (右)

材料和方法

试剂

以下Fmoc氨基酸购自CEM Corporation (Matthews,NC) 并包含指定的侧链保护基团：Ala、Arg(Pbf)、Asp(OMpe)、Gly、His(Boc)、Ile、Leu、Lys(Boc)、Pro、Ser(tBu)、Thr(tBu)和Val。Rink Amide ProTideTM LL 树脂和Fmoc-Ala-Wang LL 树脂也购自CEM Corporation。Fmoc-Ser(GlcNAc(Ac)3-β-D)-OH和Fmoc-Thr(GlcNAc(Ac)3-β-D)-OH购自EMD Millipore (Burlington,MA)。N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、哌啶、吡咯烷、三氟乙酸(TFA)、3,6-二氧杂环己烷(DODT)和三异丙基硅烷(TIS)购自Sigma-Aldrich (St. Louis,MO）。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、无水乙 醚(Et2O)和乙酸购自VWR(West Chester,PA)。LC-MS级水(H2O)和LC-MS级乙腈(MeCN)购自Fisher Scientific(Waltham,MA)。

多肽合成:WbwA底物,Thr(GlcNAc(Ac)3-β-D)-SAPDTRPAPGSTAP-NH2

使用CEM Liberty Blue自动微波肽合成仪在Rink Amide ProTide树脂LL（离子交换容量：0.18meq/g）上以0.05mmol的规模合成肽。用DMF中的哌啶进行脱保护。在DMF中，在5倍过量的Fmoc-AA与DIC和Oxyma Pure（与DIEA）中进行偶联反应(CarboMAX)6。Fmoc-Thr(GlcNAc(Ac)3-β-D)-OH用于糖基化氨基酸。使用TFA/H2O/TIS/DODT在室温下进行裂解2小时。裂解后，用无水乙 醚沉淀肽并过夜冻干。

多肽合成：TUS-APF 类似物,

KLKIKRPVK-Ser(GlcNAc(Ac)3-β-D)-VPAAVVVA-CO2H

使用CEM Liberty PRIME自动微波肽合成仪在Fmoc-Ala-Wang LL树脂（离子交换容量：0.31meq/g）上以0.10mmol规模合成肽。用吡咯烷在DMF中进行脱保护。在 DMF中以5倍过量的Fmoc-AA与DIC和Oxyma Pure进行偶联反应(CarboMAX)6。Fmoc-Ser(GlcNAc(Ac)3-βD)-OH用于糖基化氨基酸。使用 TFA/H2O/TIS/DODT在室温下进行裂解2小时。裂解后用无水乙 醚沉淀肽并冻干过夜。

多肽分析

在配备有PDA检测器的Waters Acquity UPLC系统上分析肽，该检测器配备Acquity UPLC BEH C8柱（1.7mm和2.1x100mm）。UPLC系统连接到Waters 3100 Single Quad MS用于结构测定。在Waters MassLynx 软件上进行峰分析。使用(i)H2O和(ii)MeCN中的0.05% TFA梯度洗脱进行分离。

结果

在Liberty Blue自动微波肽合成仪上使用微波增强SPPS合成WbwA Substrate，产生了纯度为68%的目标肽（图 2）。

图 2 ：WbwA Substrate的UPLC色谱图

Liberty PRIME自动微波肽合成仪上使用微波增强SPPS合成TUS-APF类似物，产生了纯度为73%的目标肽（图3）。

图 3 ：TUS-APF 类似物的UPLC色谱图

结论

使用自动微波增强SPPS可以快速有效地合成具有O-连接聚糖的糖肽。使用Liberty Blue肽合成仪在3小时10分钟内合成了纯度为68%的WbwA肽底物。在Liberty PRIME上，微波增强的SPPS在1小时8分钟内提供TUS-APF类似物，纯度为73%。此外，该方法通过使用少于2个当量非常昂贵的Fmoc保护的糖氨基酸，降低了O-连糖肽的总体合成成本。