- 2022-10-29 15:21:10 来源:杭州奥盛仪器有限公司 浏览量:467次
- 【导读】聚合酶链式反应(PCR):一种对特定的靶核酸片段在体外进行快速扩增的方法。通常由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成,通过不同温度的循环实现靶核酸的扩增。
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01
常规PCR和荧光定量PCR的区别是什么呢?
聚合酶链式反应(PCR):一种对特定的靶核酸片段在体外进行快速扩增的方法。通常由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成,通过不同温度的循环实现靶核酸的扩增。
实时荧光定量PCR (Real-time qPCR) 是在PCR技术基础上发展起来的核酸/基因检测技术,是一种在PCR反应体系中加入荧光标记探针或荧光染料,通过采集荧光信号出现的先后顺序以及强弱的变化,搭配软件分析Ct值和标准曲线,对目的基因进行定性或定量分析的方法。
02
荧光定量PCR反应体系的组成都有什么呢?
荧光定量PCR反应体系包括:核酸模板、引物、热稳定DNA聚合酶、四种dNTP、荧光染料或Taqman探针以及含有Mg2+ 等的缓冲液。一般配置20μL或50μL体积的反应体系。
核酸模板
通常配置20 μL反应体系时,模板的使用量小于100 ng,逆转录产物作为模板时,模板量不超过体系终体积的20%。模板进行逆转录实验,常用于基因表达的检测,在材料收集过程中,样本需要立刻液氮速冻,并迅速转移到超低温冰箱保存,尽量避免RNA的降解。一般将实验材料分为对照组和处理组,组内要有3组以上重复,以便后续对偏差较大的数据进行处理。
DNA聚合酶
在进行荧光定量PCR实验时,需要选择合适的耐热聚合酶,具体需参考酶的特异性、保真性、耐热性、扩增速率等多个指标。目前市面上较常用的是Taq DNA聚合酶,其他还有Vent系列、KOD系列、Pfu系列等多种类型的DNA聚合酶。
引物
是指人工合成的两段寡核苷酸序列,其中一个引物与对应的DNA模板链目标区域3’端的碱基互补,另一个引物与另一条DNA模板链目标区域5’端的碱基互补。
脱氧核苷三磷酸(dNTP)
dNTPs是dATP、dGTP、dTTP、dCTP的统称。dNTPs作为DNA复制原料,它直接影响扩增产物的产量、特异性以及保真性,因此在实验过程中需要选择浓度准确、纯度高的试剂。
缓冲液
缓冲液的作用是为DNA聚合酶活性提供适宜的化学环境。通常缓冲液的pH为8.0-9.5,改变pH会影响核酸扩增量。另外缓冲液的关键组分Mg2+是酶工作所必需的离子,与 dNTPs 和模板螯合在一起,成为 DNA 聚合酶识别的底物。目前市面上的常用的缓冲液一般是2×的浓缩液,按照说明书的添加量配置即可。
荧光团基
荧光化学物质可分为:荧光染料和荧光探针。
荧光染料以SYBR Green为代表,与DNA小沟区域非特异性结合,每形成一条双链,就有染料与双链DNA结合。通过光源激发染料产生荧光信号,荧光信号强弱与DNA双链数量成正比。
荧光探针的发光机制与染料不同,利用的是一对能产生荧光共振能量转移的基团,即5′端的报告基团和3′端的淬灭基团。探针完整时,报告基团的荧光信号被淬灭基团所淬灭,扩增时,5'端外切酶活性将探针水解切割,报告基团和淬灭基团分离,荧光信号开始积累。
荧光基团
荧光染料
荧光探针
常见试剂
SYBR Green I
FAM 、TET、HEX 等
特异性
对DNA无特异性
探针与DNA特异性结合
灵敏度
灵敏度低,适合大量拷贝的
基因定量
灵敏度高,适合检测微量基因产物或microRNA
目的片段
同一反应检测一个目
的片段
同一反应同时检测多个目的片段
成本
低
高
总的来说,荧光定量PCR作为核酸定量常用的检测方法,体系配置简单,适用范围广泛。在进行qPCR实验时,不管是选择荧光染料还是荧光探针,检测方法都很有效,可以根据本身材料情况,选择适合的方法。
Esan-Gene 162/164
- 标签:荧光定量PCR反应体系 , 荧光定量PCR , DNA聚合酶
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荧光定量PCR基础知识小课堂(一)
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