- 2022-11-16 15:27:28 来源:阿拉丁试剂(上海)有限公司 浏览量:854次
- 【导读】亚磷酰胺法由Marvin Caruthers在1980年代初期开创,并通过固相技术和自动化的应用得到加强,现已成为首 选方法。
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多年来,寡核苷酸的合成方法发展历程:,从 Michelson和Todd 早期的H-膦酸酯和磷酸三酯法[1],以及Khorana在 1950 年代的磷酸二酯法[2],再到1960年代磷酸三酯法的重新研究和1970年代的亚磷酸三酯法[3]。这些方法中的每一种都存在其弊端。亚磷酰胺法由Marvin Caruthers在1980年代初期开创,并通过固相技术和自动化的应用得到加强,现已成为首 选方法。
亚磷酰胺法
亚磷酰胺寡核苷酸的合成沿3'至5'方向进行(与DNA 复制中生物合成的5'至3'方向相反)。每个合成周期添加一个核苷酸[4]。
图1.亚磷酰胺寡核苷酸合成循环
DNA合成的亚磷酰胺单体主要由碱基、脱氧核糖、5'端的DMT和3'端的2-氰乙基以及二异丙基胺基组成。此外,由于腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤和一些人工碱基存在伯氨基,因此也需要在单元中用适当的保护基团对其保护。在寡核苷酸合成之前必须从载体结合的核苷中脱去DMT保护基团。
步骤1:活化和偶联
在进行偶联之前,活化剂四唑提供一个质子给亚磷酰胺单体3'磷酸上二异丙胺基的氮原子,质子化的二异丙胺是一个良好的离去基团,与四唑形成亚磷酰胺四唑这种活性中间体,这个过程被称为活化。脱保护的5'端-OH会与亚磷酰胺四唑活性中间体偶联,形成新的磷氧键,并脱去四唑。在这一步核苷酸链得到延伸,需要注意的是:单体及活化剂中水分超标导致偶联效率低,原料中杂质较多也会导致偶联效率低。
图2.亚磷酰胺偶联反应机理
核苷亚磷酰胺在惰性气体氛围中相当稳定,可以用于制备与运输,并可以在使用前以干燥固体形式储存数月。只有在质子化作用时,核苷亚磷酰胺才具有反应性。
步骤2:加帽
在每个偶联步骤中使用大大过量的四唑和亚磷酰胺单体可以将每一步偶联的效率提高到99.5%以上,但即使使用最有效的化学方法和纯度最 高的试剂,也不可能实现100%的核苷都参与反应。这意味着核苷酸上会有一些未反应的 5'-羟基;如果不加以控制,这些 5'-羟基将可用于参与下一个偶联步骤,并与引入的亚磷酰胺反应,导致得到的寡核苷酸会缺少一个碱基,并且对应于所需寡核苷酸的缺失突变。如果不检查这种缺失突变,它们会随着每个连续的循环而累积,最 终产物将是寡核苷酸的复杂混合物,其中大部分将携带不正确的遗传信息,并且难以纯化。这还会导致后续生化实验的失败。
图3.正确寡核苷酸的缺失突变序列(上);和一个包含缺失突变的失败序列(下),对应于第 6 位胸腺嘧啶碱基的缺失。
通过在偶联反应后引入“加帽”步骤来避免缺失突变,以阻断未反应的5'端-OH。合成器上使用了两种封端溶液:乙酸酐和N-甲基咪唑 (NMI)。这两种试剂(溶解在四氢呋喃中并添加少量吡啶)在输送到合成柱之前在 DNA 合成仪混合。亲电子混合物快速乙酰化,吡啶确保 pH 值保持碱性,以防止由乙酸酐与 NMI 反应形成的乙酸对核苷亚磷酰胺进行脱保护。 5'端-OH的乙酰化即可使它们对随后的反应呈惰性。
图4.亚磷酰胺寡核苷酸合成中加帽步骤的机理
步骤3:氧化
偶联反应后新加上的核苷酸通过亚磷酯键(磷为三价)与寡核苷酸链相连,此亚磷酯键不稳定,易被酸、碱水解,因此需将此处三价磷氧化为五价的磷。被氧化后形成的磷酸二酯键实际上就是DNA链中的磷酸二酯键外加一个2-氰乙基保护,该保护基可以使磷酸二酯键在后续的合成中更稳定。这一步常用的氧化剂为碘的四氢呋喃溶液,此步反应速度亦很快。
图5.亚磷酰胺寡核苷酸合成中氧化步骤的机理
在一些 DNA 合成仪上,碘氧化后还有第二个加帽步骤。这样做的目的是干燥磷酸酯,因为氧化混合物中的残留水会持续存在并抑 制下一次偶联反应。过量的水与酰化剂反应形成乙酸,该乙酸会在THF/吡啶溶剂混合物中被除去。
步骤4:脱保护
在磷酰胺偶联、封端和氧化后,必须脱去核苷酸5'端的DMT保护基,以便伯羟基可以与下一个核苷酸亚磷酰胺进行偶联反应。在二氯甲烷中用三氯 乙酸脱保护是快速且定量的。注意太浓缩的TCA溶液或太长的脱三苯甲基化时间会导致脱嘌呤,因而会降低最终寡核苷酸的总产率。裂解产生的DMT碳阳离子显示橙色,它在495nm处有可见光吸收,可通过检测其吸光度监测偶联效率。
这一步结束后,延伸后的寡核苷酸链进入下一循环,然后不断重复循环直至链延伸至所需长度。
参考文献:
1. A. M. Michelson,Alexander R. Todd. Nucleotides part XXXII. Synthesis of a dithymidine dinucleotide containing a 3′: 5′-internucleotidic linkage[J]. Journal of the Chemical Society (Resumed),1955,0(0). https://doi.org/10.1039/JR9550002632
2. P. T. Gilham,H. G. Khorana. Studies on Polynucleotides. I. A New and General Method for the Chemical Synthesis of the C5’-C3’ Internucleotidic Linkage. Syntheses of Deoxyribo-dinucleotides1[J]. J. Am. Che m. Soc.,2002,80(23). https://doi.org/10.1021/ja01556a0163. Reese Colin B..The chemical synthesis of oligo-and poly-nucleotides by the phosphotriester approach[J]. Tetrahedron,1978,34(21). https://doi.org/10.1016/0040-4020(78)87013-6
4. 4.Beaucage S.L.,Caruthers M.H.. Deoxynucleoside phosphoramidites--A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis[J]. Tetrahedron Letters,1981,22(20). https://doi.org/ 10.1016/S0040-4039(01)90461-7 - 标签:寡核苷酸合成 , 固相技术
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寡核苷酸合成
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