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- 【导读】传代培养细胞染色体显示法1.培养细胞:取处于指数生长期、用较大瓶皿培养的、80%~90%汇合单层培养细胞。2.加秋水仙素:使用最终浓度为0.02~0.8微克/毫升营养液,温箱继续培...
传代培养细胞染色体显示法
1.培养细胞:取处于指数生长期、用较大瓶皿培养的、80%~90%汇合单层培养细胞。
2.加秋水仙素:使用Z终浓度为0.02~0.8微克/毫升营养液,温箱继续培养6~10小时;或用低温封闭法:把培养细胞置于4℃条件下6~12小时后,再于37℃温箱继续培养6~10小时处理(加秋水仙素)。
3.采集分裂细胞:可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点,此时手持培养瓶,左右反复横向水平摇动,令培养液在培养细胞表面反复冲刷。应用此法可使90%的中期分裂细胞从瓶壁脱落,注意勿用力过猛,以防多量非分裂细胞脱落影响观察。
4.离心:收集培养液,1000转/分钟离心5~10分钟。
5.低渗处理:吸除上清液、加入预温至37℃的0.075MKCl溶液,在温箱中静置20~30分钟。
6.预固定:向悬液中加新鲜1:3醋酸、甲醇固定液1ml,用吸管吹打调匀,此措施能起到先使细胞表面轻微固定,可防止固定后细胞粘连成块。
7.固定:离心,同4,吸除上清液,加新鲜固定剂5~10ml;加固定剂时要用一手微斜持离心管,另手用吸管吸取固定剂,把固定剂逐滴滴在离心管壁上,使之慢慢流入离心管中,然后轻轻吹打均匀,置15~20分钟。
8.重复7,末次离心后,小心吸除大部分上清,据悬液中细胞密度大小,余下固定液0.5~1ml。
9.制片:用滴片法制片,按如下步骤:彻底洗净载物片,勿留任何油脂,置冰箱中储备备用。滴片前现从冰箱中取出冷载物片1片,在载物片表面出现细微水气时,立即向片的一侧滴2~3滴细胞悬液,滴片时的距离能保持半米高度才好。滴片后置室温中令其自然干燥,或用吹风机热风吹干亦可。如此制备好的标本可置盒中备用或立即进行染色观察。
10.染色和封片:一般常用Giemsa染色:取干液Giemsa1份加pH6.8磷酸缓冲液9份混合,染色10分钟后,水洗、晾干、可直接观察。如标本需要保存或做长时间观察,可过二甲苯两次后,用中性树胶封片后,再过二甲苯,然后封片亦可。
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