流式分析样品的准备

流式一、

样品的准备

试验一：组织培养细胞的细胞准备

材料

AccutaseTMEnzymeCell完全培养基（eBioscienceCat.No.00-4555）　　流式细胞仪染色液（eBioscienceCat.No.00-4222）　　15或50ml尖底离心管

实验过程

1．对于悬浮培养的细胞，把细胞分装到一个尖底离心管中，对细胞进行计数和活性分析，然后进入步骤3；

2．对于贴壁培养的细胞，建议用AccutaseTMEnzymeCell完全培养基从培养皿上吹起并吹散细胞凝聚物，然后把细胞分装到一个尖底离心管中，对细胞进行计数和活性分析，进入步骤3；

3．离心细胞然后用流式细胞仪染色液重悬细胞使其终浓度为2×107个细胞/ml。

试验二：淋巴组织的细胞准备

材料

60×15mm组织培养皿

3ml注射器

细胞滤网（血液尼龙滤网）

流式细胞仪染色液（eBioscienceCat.No.00-4222）

15或50ml尖底离心管

实验过程

1．采集组织（采集组织（脾，淋巴结，胸腺）放进一个细胞培养皿中，用3ml注射器的活塞挤压以制成单细胞悬液，此过程用10ml的染色缓冲液；

2．加入10ml染色液收集细胞，使细胞悬液通过尼龙滤网以除去成团的细胞和细胞碎片，收集细胞悬液于尖底离心管中；

3．4℃离心细胞悬液4-5分钟（300-400g），弃掉上清液；

4．重悬细胞沉淀，细胞计数和活性分析；

5．按照步骤3离心细胞然后用合适体积的染色液重悬细胞，使细胞终浓度为2×107个细胞/ml。

试验三：非淋巴组织的细胞制备

材料

剪刀或者手术刀片

PBS

60×15mm组织培养皿

3ml注射器

细胞滤网（血液尼龙滤网）

流式细胞仪染色液（eBioscienceCat.No.00-4222）

15或50ml尖底离心管

实验过程

1．采集组织，用剪刀或手术刀切成2-4mm的小块；

2．按照酶的使用说明书，加入适量用PBS稀释的酶，孵育。酶的选择可以参照以下网站：http://www.tissuedissociation。。ｃｏｍ；

3．用移液管轻轻吹散细胞，并用滤网过滤除去成团的细胞和细胞碎片；

4．4℃离心细胞悬液4-5分钟（300-400g），弃掉上清液；

5．用PBS重悬细胞沉淀以移除剩余的酶溶液；

6．重复步骤4；

7．重复步骤5和6；

8．用流式染色液重悬细胞沉淀，细胞计数和活性分析；

9．按照步骤4离心细胞然后用合适体积的染色液重悬细胞，使细胞终浓度为2×107个细胞/ml。

试验四：

材料

PBS

FicollTM或其它的培养基

流式细胞仪染色液（eBioscienceCat.No.00-4222）

15或50ml尖底离心管实验过程

1．在尖底离心管中用PBS按1:1的比例稀释血样；

2．用FicollTM等倍稀释样品；

3．离心20分钟；

4．收集PBS和FicollTM交界处的PBMC；

5．在试管中加入PBS；

6．4℃离心细胞悬液4-5分钟（300-400g），弃掉上清液；

7．用流式染色液重悬细胞沉淀，细胞计数和活性分析；

8．按照步骤6离心细胞然后用合适体积的染色液重悬细胞，使细胞终浓度为2×107个细胞/ml。

用淋巴组织细胞悬液在流式细胞仪上分析以前，Z好去掉红细胞。

试验一：鼠脾细胞中红细胞的裂解：

材料

1×PBS

eBioscience红细胞裂解液(Cat.No.00-4333)

50ml尖底管

1．采集小鼠的并且制成单细胞悬液；

2．4℃离心沉淀细胞（300-400g），弃掉上清液；

3．用5ml脾的红细胞裂解液重悬细胞；

4．室温震荡孵育4-5分钟（也可在冰上进行）；

5．加入20-30mlPBS停止反应；

6．4℃离心沉淀细胞（300-400g），然后用合适体积的缓冲液重悬细胞沉淀，继续下一步试验；

7．细胞计数。

试验二：小鼠血液的红细胞裂解

材料

1×PBS

eBioscience红细胞裂解液(Cat.No.00-4333)

50ml尖底管

1．1ml小鼠血液中加入10ml红细胞裂解液；

2．室温震荡孵育4-5分钟（也可在冰上进行）；

3．加入20-30mlPBS停止反应；

4．4℃离心沉淀细胞（300-400g），然后用合适体积的缓冲液重悬细胞沉淀，继续下一步试验；

5．细胞计数。

试验三：人外周血中红细胞的裂解

材料

1×PBS

eBioscience红细胞裂解液(Cat.No.00-4333)

50ml尖底管

1．1ml人的血液中加入10ml红细胞裂解液；

2．室温孵育10分钟（不要超过15分钟）；

3．加入20-30mlPBS停止反应；

4．4℃离心沉淀细胞（300-400g），

然后用合适体积的缓冲液重悬细胞沉淀，继续下一步试验；

5．细胞计数。

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