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- 【导读】(一)原理Northern杂交(Northernblotting)是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术,首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶...
(一)原理
Northern杂交(Northernblotting)是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术,首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,分离出来的RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上,再与放射性标记的探针杂交,通过杂交结果可以对表达量进行定性或定量。
Northern杂交是用来测量真核生物RNA的量和大小估计其丰度的实验方法,可以从大量的RNA样本同时获得这些信息。其基本步骤包括:①完整mRNA的分离;②根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离;③将RNA转移到固相支持物上,在转移的过程中,要保持RNA在凝胶中的相对分布;④将RNA固定到支持物上;⑤固相RNA与探针分子杂交;⑥除去非特异结合到固相支持物上的探针分子;⑦对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析。ELISA试剂盒
(二)材料
1.待检测的RNA及制备好的探针。
2.试剂DEPC、琼脂糖(电泳级)、MOPS电泳缓冲液(10×和l×)、37%甲醛溶液(pH>4)、甲酰胺、甲醛加样缓冲液、SSC(10×、20×、l×、0.25×)、10mg/ml溴化乙啶、Northern杂交溶液、N0rthern杂交溶液、O.1%SDSDEPC处理的双蒸水。
3.仪器及器材60℃水浴箱、平台式摇床、硝酸纤维素膜、滤纸、杂交袋、电泳装置和放射自显影所需试剂和设备。
(三)方法
1.凝胶或甲醛凝胶的准备
(1)配制1.2%琼脂糖凝胶:将4.2g琼脂糖加入304.5ml水中(用500ml角烧瓶),放入微波炉内溶化后,置于60℃水浴中(凝胶量应根据所需制备的凝胶板大小来决定,一般是20cm×20cm的凝胶板)。
(2)当琼脂糖凝胶凉至60℃时,加入35ml10×MOPS电泳缓冲液,并加入10.5ml37%甲醛溶液,充分混匀。
(3)准备好电泳槽,并将加样孔成形梳插入,使梳顶端与槽底约有1mm距离,倒入上述甲醛琼脂糖凝胶溶液,冷却30~45min,小心抽出梳子,加人1×MOPS电泳缓冲液,淹没凝胶表面(加样孔大小约10mm×lmm,以便能加入约60ul样品)。ELISA试剂盒
2.RNA电泳及转移
(1)混合液的配制:用5p110×MOPS电泳缓冲液、8.755μl37%甲醛、25μl甲酰胺。
(2)将RNA样品加入混合液中,Z后加水至50μl,Z好每种RNA样品做一重复对照:一种RNA样品的用量为O.5~1.Oμl,如果待测的RNA在总RNA中含量较高,可以直接用总RNA为样品(如<0.05%),否则用Poly(A)+RNA代替。
(3)充分混匀样品,离心5~10s,在55℃中温育15min。
(4)每种样品加入10μl甲醛加样缓冲液,混匀并离心,立即加样。
(5)5V/cm电泳3h,待二甲苯蓝指示剂泳动到凝胶的一半距离时结束电泳。
(6)将完成电泳后的凝胶直接转移到一大盘内,用DEPC理的双蒸水漂洗数次,以除去甲醛(转移用RNA凝胶不用EB染色,而重复对照组可用EB染色,并与标准RNA的分子量对照)。
(7)倒出漂洗液,加入500ml10×SSC盘中,将盘置于平台式摇床上轻摇45min。
(8)将凝胶块置于塑料胶片上,测量胶块的长与宽,然后再将胶块放人lO×SSC中。
(9)剪下比胶块约小3mm的一块硝酸纤维素膜,将硝酸纤维素膜在盘中浸湿约1min,
然后再将膜放入20×SSC中5~10min。操作时应戴手套,防止手上的油脂污染膜面。(10)将凝胶块左下角切去,以便定位。准备一玻璃平台,置于一装有20×SSC的大盘之中,在平台上铺上一层滤纸(Whatman3mm滤纸),此纸要比胶块宽约2cm、长30~40cm,使纸两端浸入台下的20×SSC之中,排除滤纸与玻璃板之间的气泡。
(11)从lO×SSC中轻轻移出凝胶块,沥干表面水分,并将其平铺在玻璃平台的滤纸上(注意,不要在凝胶与滤纸之间形成气泡)。将硝酸纤维素膜从20×SSC中取出,平铺在胶块的表面,剪去左下角(注意:硝酸纤维素膜的面积不要大于胶块,也不能在膜与胶块之间形成气泡)。
(12)将准备好的吸水滤纸2~3张放入20×SSC中浸湿,然后置于吸水纸上,吸干多余水分,将其铺在硝酸纤维素膜上(注意:这一叠纸的面积不能超过下面硝酸纤维素膜,四周Z好留出2~3mm,纸与膜之间不能存在气泡)。
(13)在diyi层吸水纸之上,放上比层析纸稍小的一叠吸水纸(5~8cm厚),再存吸水纸上加一块玻璃板,其上可以压上约500g的重物。转移液在吸水纸的虹吸作用下从容器中转移到吸水纸上,从而带动凝胶中小的RNA转移到硝酸纤维素膜上。
(14)用保鲜膜将盛有转移液的盘于盖上,减少蒸发作用。需要保持转移时间6~24h,其问更换吸水纸1~2次。
(15)用镊子除去层析纸,将硝酸纤维素膜置于一张干燥滤纸上,用记号笔标明加样孔的位置。
(16)硝酸纤维素膜用6M×SSC浸泡5min,以去掉琼脂糖块。
(17)干燥硝酸纤维素膜,将其置于两层干燥滤纸之间,70~80℃烘干下2h。
(18)此硝酸纤维素膜可以用于下一步杂交反应,也可用铝箔包好,室温下真空中保存备用。
3.预杂交、杂交和洗膜
(1)将烘干的硝酸纤维素膜放人一个可以封口的杂交袋内,加入6~10mlNorthern预杂交溶液(量的多少根据纤维素膜的大小而定)。封闭杂交袋(预杂交液应加入袋底层,排除其中气泡,用封口机将袋口封牢)。前后摇动袋子数次,以使硝酸纤维素膜充分湿润。
(2)于37~42℃恒温水浴箱中,保温过程中不时将杂交袋摇动数次。
(3)将准备好的放射性或非放射性标记探针置入6~10mlNorthern杂交液中,取此液6~10ml,煮沸探针5min,然后加入Northern杂交液混匀。
(4)将杂交袋剪开一个小口,倒出预杂交液,Z好将袋放在一平面台上,用10ml加样器头轻挤压一下。
(5)加入杂交液与探针混合液,使之在膜上分布均匀,然后再次排出气泡,密封袋口。为防止放射性污染,可以在袋外再加套一个保护袋。
(6)置于37~42℃恒温水浴箱中。ELISA试剂盒
(7)次日剪开袋口,取出硝酸纤维素膜,洗膜。方法如下:用1×SSC加入O.1%SDS,室温下洗2次,每次15min,然后再加入O.25×SSC(含O.1%SDS),室温下洗2次,每次15min。
(8)在室温下.硝酸纤维素膜用O.1×SSC稍稍漂洗,用层析纸吸去硝酸纤维素膜上多余水分。进行放射自显影.一般经过24h后可在x线胶片上显现RNA条带。如系非放射性标记探针,可用酶或荧光染色分析。
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