脓毒症动物模型

脓毒症相关性脑病在脓毒症患者是一种常见并发症，合并脓毒症相关性脑病者病死率明显增加。目前临床对于脓毒症相关性脑病仍是排除性诊断，缺乏客观的诊断指标，如生化指标、影像学指标、电生理学指标等，导致流行病学及发生机制均不明确，因此确立相对客观统一的诊断标准势在必行。动物模型的选择建立对其机制及ZL方法研究具有重要意义。研究人员应用脑电图和诱发电位监测早期诊断脓毒症相关性脑病，取得一定效果，但尚未形成统一结论。根据已有脓毒症相关性脑病模型研究的进展，选用盲肠结扎法（CLP）建立脓毒症模型，通过监测大鼠神经行为学改变、脑电图信号及体感诱发电位改变等来早期诊断脓毒症相关性脑病，并对所建立的大鼠脓毒症脑病模型进行分析。

1材料与方法

1.1实验动物

清洁级成年雄性SD大鼠30只，体质量200～250g，由中南大学动物学部提供。

1.2主要药品、试剂、仪器

PBS购自鼎国生物工程公司，水合氯醛为中南大学湘雅医院药剂科化学分析室配制；多聚甲醛购置岳麓区鼎盛实验器材公司；戊二醛、无水乙醇、二甲苯、苏木素、伊红、锇酸等由中南大学病理教研室提供。套管针购置BD公司。脑立体定位仪，RM6240生物信号记录器，OlympusBX41型光学显微镜（日本），LKB-Ⅲ型超薄切片机（瑞典），H-7500型透射电镜（日本），石腊切片机（美国），生化培养箱（广东），格兰士微波炉WP700，隔水式电热恒温培养箱（上海跃进YL器械厂），荣事达家用冷藏冰箱BCD-202，MIAS医用图像分析管理系统电子摄像。

1.3实验方法

1.3.1大鼠脑电及诱发电位监测电极放置30只大鼠称质量、编号分别在造模前10d放置脑电监测电极。水合氯醛腹腔注射麻醉后，大鼠头部用立体定位仪固定，常规外科消毒，在头颅中间矢状位作3cm的皮肤切口，将前囟点和其他颅骨缝暴露。在颅骨面行局麻（10%利多卡因喷雾），移去骨膜。用牙科钻在头颅钻三个孔，将3根0.6mm的不锈钢螺丝轻轻置入直到到达脑功能定位处的硬脑膜：一个电极被安装在躯体感觉皮质处（记为S1电极）（前囟点后2.5mm，右侧矢状缝旁开2.5mm），剩余两个电极被安装在额窦上面（前囟点前10mm，矢状面侧边1mm），另外左侧的电极用作接地电极。放置好电极后用牙托粉将电极固定在头颅上，封闭骨孔，皮肤缝合。手术区域每6h呋喃西林涂抹1次。

1.3.2脑电活动评估大鼠头部用立体定位仪固定，利用固定于额部的S1电极记录脑皮层电图，对侧的额窦电极作为信号地线。通过脑电图机记录信号，0.5～3Hz（δ），4～8Hz（θ），8～13Hz（α）和13～30Hz（β）频带。SEF95（低于95%能量的频率）和MF中位频率（中频=低于50%功率的频率）分析出来。同时记录每只大鼠出现棘波的Z早时间。诱发电位监测：两个刺激电极固定在左侧尾巴的中内三分之一范围内，两电极相隔2mm。通过这两个电极的刺激大鼠后，可以产生躯体诱发电位。刺激是2ms的方形波脉冲，这些方形波脉冲由RM6240产生。S1电极记录躯体诱发电位。身体同侧的额窦电极作为参考电极。对侧的额窦电极作为信号地线。测量结果由两个正电位（p1和p2）与一个负电极位（N1）组成。峰值基线和峰值潜伏期被估量出来。

1.3.3动物模型制作及分组10d后，大鼠称质量、编号、随机分组，术前禁食12h。10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，股静脉置管开放静脉通路，股动脉置管后连接RM6240生物信号记录器，持续监测血压、心率。大鼠用盲肠结扎穿孔模型（CLP）方法诱发脓毒症，常规消毒铺巾，在大鼠侧腹开2cm的刀口，暴露出盲肠，然后在回盲肠连接处结扎。用22#注射针头将盲肠刺穿两次，轻轻挤压盲肠使其内的粪渣流进腹膜。然后将盲肠送回腹腔，Z后关闭腹腔。假手术组的动物同样开腹，除了结扎和穿刺操作外，盲肠也要被执行其他同样操作。所有手术动物皮下注射生理盐水（3ml/100g），手术结束后切口用络合碘消毒液清洗。术后每6h需要用2%呋喃西林涂抹于手术区域。观察大鼠神经行为学改变，监测CLP后4、6、8、12、24h脑电图，并记录脑电波形改变及体感诱发电位数值。脓毒症组大鼠按24h内有无脑电图和诱发电位改变分为脓毒症无脑病组和脓毒症相关性脑病组。

1.3.4脓毒性脑病大鼠的诊断标准及规定参照Siami等的研究，脓毒症大鼠出现神经行为学改变，同时脑电图监测出现δ波明显增加，诱发电位P1振幅明显降低，S-P1和N1-P1潜伏期明显延长判定为出现脓毒症相关性脑病。

1.4观察和检测指标

1.4.1大鼠神经行为学改变评价评价大鼠耳廓反射、角膜反射、翻正反射、甩尾反射和逃避反射改变。耳廓反射通过轻触外耳道引起头部有力转动为正常；角膜反射通过用棉签轻触大鼠角膜引起眨眼或头部摇动为正常；翻正反射通过将大鼠仰卧位放置，观察其是否能翻身成俯卧位，并前后脚放平。甩尾反射和逃避反射通过短暂刺激大鼠尾部引起躲避或转头逃避伤害刺激的反应。0分为无反射，1分为反射减弱（10s以内缺乏反射），2分为正常反射。每只大鼠Zgao评分为10分。

1.4.2脑电图及诱发电位改变持续监测大鼠从致伤开始后的脑电图改变，并应用RM6240生物信号记录器分析0.5～3Hz（δ），4～8Hz（θ），8～13Hz（α）和13～30Hz（β）频带比例。同时监测大鼠呼吸频率、心率、血压变化。　　

1.4.3灌注固定与脑组织取材行病理学及透射电镜检查24h后存活大鼠给予水合氯醛0.3～0.4ml/100g腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧位固定于实验台上，经左心室插入细导管，继续向上推进直至导管进入主动脉弓处，剪开右心耳。先以生理盐水约200ml灌注至流出液无色，肝脏变白后，继以4%多聚甲醛150ml灌注。灌注完毕后取脑组织，选取大脑额叶皮质及海马组织，一部分置于4%多聚甲醛中固定24h，经脱水、透明、浸蜡、包埋，制成4μm厚的连续切片。另一部分置于2.5%戊二醛固定24h以上，行透射电镜检测。

1.5统计学方法

实验数据采用SPSS17.0统计软件在WindowsXP环境下处理，所有数据均进行正态性检验和方差齐性检验。所有计量资料结果均采用均数±标准差（x±s）表示，均数间两两比较采用SNK-q检验（Student-Newman-Keula，S-N-K法），计数资料采用χ2检验，P<0.05差异有统计学意义。

2结果

2.1一般情况及脓毒症相关性脑病发生率

CLP大鼠出现蜷缩少动、竖毛和呼吸急促（>自身对照值2倍）表现。心率由正常的（358.2±8.8）次/min升至（453.3±12.9）次/min，平均动脉血压由正的（107.60±3.85）mmHg（1mmHg=0.133kPa）降至（60.71±4.23）mmHg。30只大鼠（假手术组5只，CLP组25只）24h内死亡12只，13只脓毒症大鼠进行了后续研究及统计，24h内6只大鼠出现神经行为学、脑电图及诱发电位改变，确定为脓毒症相关性脑病，其发病率为46%。

2.2神经行为学、脑电图及体感诱发电位改变

假手术组大鼠神经生物学评分基本正常，24h时脓毒症无脑病组及脓毒症相关性脑病组神经生物学评分明显下降（P<0.05），但脓毒症无脑病组与脓毒症相关性脑病组间差异无统计学意义（P>0.05）。脓毒症相关性脑病组24h时α波较假手术组和脓毒症无脑病组明显下降，δ波增加（P<0.05），脓毒症无脑病组与假手术组相比差异无统计学意义（P>0.05）。与假手术组及脓毒症无脑病组相比，脓毒症相关性脑病组24h时P1振幅下降，S-P1和N1-P2潜伏期延长（P<0.05），P1-N1无明显改变（P>0.05）；而脓毒症无脑病组与假手术组差异无统计学意义（P>0.05）。脓毒症相关性脑病组内神经生物学评分、脑电图改变及体感诱发电位改变在术后6h开始出现，24h时与术前相比差异具有统计学意义，表现为神经生物学评分下降，α波降低，δ波增加，P1振幅下降，S-P1和N1-P2潜伏期明显延长（P<0.05）。

2.3脓毒症相关性脑病大鼠的病理形态学检查结果

光镜下可见假手术组大鼠神经元及胶质细胞大小正常，形态清晰，锥体细胞突起明显，细胞结构清晰；脓毒症无脑病组大鼠24h后可见部分神经元及胶质细胞形态改变，细胞结构不清晰，但无明显神经元固缩及血管改变；脓毒症相关脑病组大鼠可见明显神经元固缩、深染，细胞结构不清，细胞周围空隙明显增大，胶质细胞周围间隙扩大，空泡样改变，血管周围间隙扩大。

2.4透射电镜超微病理检查结果

透射电镜结果显示，假手术组大鼠海马和额叶区神经元形态完整，结构清晰，核膜完整，核形态正常，胞质中细胞器丰富；线粒体形态正常，呈圆形或椭圆形，嵴较多而清晰可见。脓毒症无脑病组大鼠海马和额叶皮质均见轻度神经元水肿，核形态基本正常，核膜尚完整，染色质均匀分布，细胞器丰富；胞质内有丰富的线粒体，大多数线粒体嵴完整，排列紧密规律，基质颗粒极少量脱落。脓毒症相关性脑病组大鼠额叶皮质神经元严重水肿，形态改变，细胞核不规则，核膜皱缩，胞质高度水肿，细胞器数量明显减少；线粒体呈气球样肿胀，大量空泡化，嵴断裂、溶解、消失，同时伴有线粒体致密化改变，而海马区亦见类似改变，程度较皮质区稍轻。

3讨论

脓毒症致病因素多种多样，不同的因素导致了发病机制差别甚大，因此不同的动物模型得出的实验结论也可能不同。Hubband等指出理想的动物模型应具备以下标准：脓毒症存在毒血症，血培养阳性，动物表现出特征性代谢及生理紊乱，脓毒症感染超过一定时间才使动物产生相应反应；同时该动物模型制作成本小，重复性好。汤耀卿和李磊提出脓毒症动物模型都必须具有脓毒症典型的高排低阻血流动力学表现和高代谢状态；伴发多个器官功能障碍，出现器官功能障碍及动物死亡距脓毒症模型制备应有一定的时间间距；有较高的自然病死率，根据脓毒症的转归，要求动物模型的自然病死率达到50%～70%。不同模型有不同的优缺点，而在临床上脓毒症Z常见同样也Z难ZL的是腹腔感染，因此腹腔内感染模型是Z常用的脓毒症模型。腹腔内感染法可将脓毒症血流动力学和生化反应成功复制，尤其是CLP堪称为“金标准”。因此在本实验中，笔者选择了盲肠结扎法制作。在进行盲肠结扎后大鼠出现蜷缩少动、竖毛、呼吸急促、心率增快、血压下降表现。25只CLP24h内死亡12只，病死率达到48%，基本符合脓毒症标准。

脓毒症相关性脑病在临床上主要表现为精神状态的急剧恶化，如认知障碍、意识混乱、定向障碍、激动、木僵或昏迷。研究认为其与脑组织的缺血缺氧及脑细胞代谢障碍相关，但其机制非常复杂目前尚不明确4。脓毒症发生时，同时会伴有肝肾衰竭、急性呼吸窘迫综合征、电解质紊乱、酸碱失衡、血糖异常、低血压、低氧血症、低温、发热或内分泌异常等，且应用镇静药、机械通气或神经肌肉阻滞药等ZL措施比较普遍，这些均使神经系统本身病变的症状和体征容易被掩盖，而目前临床判断SAE大多还是根据其症状和体征，并没有客观辅助检查的诊断标准，于是确立和早期诊断脓毒症相关性脑病尤为重要，脑电活动的改变可能成为重要的评价标准。有研究认为，SAE可以根据患者的意识状态，认知功能的改变评估和脑电图记录的脑电活动来诊断。脑电图改变程度与临床严重程度的相关性因素可以表现为从慢频波的增加到额外的三相波出现甚至严重情况下的突发YZ。动物实验研究报道，对LPS模型的脓毒症大鼠进行脑电图监测，发现在全身血流动力学没有显著改变情况下，α波明显下降，被认为是脑部局部血流减少的迹象，对早期发现脑部低灌注可能有重要意义。在一项应用盲肠结扎法制作脓毒症大鼠模型监测脑电图改变研究中，发现24h内大鼠的整体脑电波形和α波幅度都有可识别的降低，可是与对照组比较差异无统计学意义。但研究分析中指出差异无统计学意义可能由于监测时间过短导致，该研究同时发现24h监测过程中，50%的大鼠出现δ波显著增加，在假手术和非手术的对照组中没有观察到类似的δ波改变，所以这些大鼠δ波增加不是手术与麻醉的影响，而是受盲肠结扎穿刺引发的炎症反应影响，导致脑病发生。因此δ波增加可能可以作为SAE模型中脑功能障碍发展的早期指标。　　

体感诱发电位（SEP）测试是一种非侵入性调查神经系统针对刺激的功能和检测从周边到神经系统体感通路的完整性的方法。当感官检验是模棱两可的时候，诱发电位所提供的功能障碍的客观示范是非常有用的。SEP的记录已经被提出可以用作估计脓毒症患者脑病的严重程度的技术。在炎诱发猪脓毒症和LPS诱发大鼠脓毒症的模型中，都已证实SEP记录的改变可能是脓毒症进展的一个早期指标的假设。在脓毒症模型基础上通过监测脑电图和体感诱发电位改变制作脓毒症相关性脑病模型取得一定进展。

研究结果显示，在整个24h监测过程中部分CLP大鼠出现神经功能改变，而脑电图监测6h即有大鼠出现α波明显下降，δ波增加，12h变化部分显著，同时伴有体感诱发电位变化，诱发电位P1振幅明显降低，S-P1和N1-P1潜伏期明显延长，在病理改变上可发现伴有神经评分改变，脑电图改变及体感诱发电位变化的大鼠出现明显神经元固缩、深染，细胞结构不清，细胞周围空隙明显增大，胶质细胞周围间隙扩大，空泡样改变，血管周围间隙扩大。同时超微透射电镜提示存在神经元严重水肿，形态改变，细胞核不规则，核膜皱缩，胞质高度水肿，细胞器数量明显减少。线粒体呈气球样肿胀，大量空泡化，嵴断裂、溶解、消失，同时伴有线粒体致密化改变，可早期诊断脓毒症相关性脑病。而脓毒症无脑病组尽管有少数大鼠也出现神经生物学评分变化，但其脑电图和体感诱发电位无明显改变，同时其病理改变上仅见部分神经元及胶质细胞形态改变，细胞结构不清晰，但无明显神经元固缩及血管改变；透射电镜结果显示，海马和额叶皮质均见轻度神经元水肿，核形态基本正常，核膜尚完整，染色质均匀分布，细胞器丰富。胞质内有丰富的线粒体，大多数线粒体嵴完整、排列紧密规律，基质颗粒极少量脱落。脑部损害明显轻于同时存在脑电图和体感诱发电位改变组。

总之，对CLP大鼠24h的研究中，24h内15只大鼠中7只大鼠出现神经行为学、脑电图及诱发电位改变，同时病理及电镜超微结构改变提示出现明显神经元损伤，线粒体结构损伤及凋亡改变，确定为脓毒症相关性脑病，其发病率为46%。因此通过对CLP脓毒症大鼠模型进行神经生物学评价，脑电监测及体感诱发电位监测可早期发现脓毒症相关性脑病，可成功建立脓毒症相关性脑病模型，为后续脓毒症相关性脑病机制研究打好基础。

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