PCR技术详解 献给初学者

实验原理：

聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR），是一种DNA的快速扩增技术，PCR技术通过基因的半保留复制功能在酶的作用下可以在几个小时内把特定的DNA片段提高几百万倍。

PCR应用：

1.分子克隆中的基因调取及验证

2.核酸序列分析（单核苷酸多态性SNP、甲基化检测等）

3.基因表达量检测（信使RNA(mRNA)、微小RNA(MicroRNA)、长链非编码RNAlncRNA等）

实时荧光定量PCR:

1、染料法：SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有激发波长的染料。在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光，一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。

2、探针法：TaqMan探针法是PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。

凝胶电泳PCR:

凝胶电泳法检测，是将扩增至指数期的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳后再用凝胶成像系统读出灰度值，根据灰度值得大小判断基因表达量的高低。

样本应用及检测

样本类型：可以用于PCR实验的样本较为广泛，例如动物或人的心、肝、脾、肺、肾、脑、、脂肪、皮肤、全血、全血分离的单核细胞、植物的根、茎、叶、花、果实等等。

1.疾病的诊断和ZL

遗传性疾病，如地中海贫血、镰刀状细胞贫血、凝血因子缺乏等有遗传倾向的疾病，尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂症，甚至肿瘤中的一部分均可预测；癌基因的检测和诊断，检测恶性肿瘤的标记物来诊断癌症等疾病；利用基因ZL方法ZL肿瘤性疾病。

2、致病病原体的检测

检测范围包括细菌、病毒（SARS、禽流感病毒H5N1等）、原虫及寄生虫、霉菌、立克次体、衣原体和支原体等一切微生物。检测的灵敏度和特异性都远高于当前的免疫学方法，所需时间也已达到临床要求，这对于难于培养的病毒（乙肝），细菌（如结核、厌氧菌）和原虫（如梅毒螺旋体）等来说尤为适用。

3、DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别和法医物证

可以用一根头发、一个细胞、一个精子来完成上述工作，这一领域也已发展到或脏器移植配型。

PCR样本的保存：

由于RNA酶广泛存在又极其稳定，易导致RNA降解，对PCR样本的保存及运输要求较高，可在待测样本中加入TRIZOL或RNAlater后再超低温（液氮、干冰、-80°C）保存运输。

实验流程

一、引物设计：

根据提供的样本种属及需检测的基因名称信息，在pubmed数据库中找出基因的源序列，再根据基因序列利用clonemanager、Premier5软件设计出扩增所需的引物。

二、RNA提取：

TRIZOL裂解样本后再用chcl3、异丙醇沉淀，使蛋白和核酸分离，提出总RNA后使用核酸定量仪测量浓度及电泳检测RNA质量。

三、CDNA逆转录：

将提取的RNA链通过逆转录酶的作用转录为单链DNA（cDNA）。

四、PCR扩增：

以cDNA样本为模板，在酶、DNTP、镁离子、引物及缓冲液的作用下进行40个循环的扩增反应，同时PCR仪在扩增过程中收集染料或探针发出的荧光并绘制扩增动力曲线。

五、数据导出和分析：

根据扩增曲线设置阈值线并导出实验数据，再将数据与参比基因对照后得出基因的表达。

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