怎么准确的冻存细胞

一、资料

（一）仪器　　1.净化作业台　　2.离心机　　3.恒温水浴箱　　4.冰箱（4℃、-20℃、-70℃）　　5.倒置相差显微镜　　6.培育箱　　7.液氮冰箱

（二）玻璃器皿　　1.吸管（弯头、直头）　　2.培育瓶　　3.玻璃瓶（250ml、100ml）　　4.废液缸

（三）塑料器皿　　1.吸头　　2.枪头　　3.胶塞　　4.移液管（10ml）　　5.15ml离心管　　6.冻存管（1～2ml）

（四）别的物品　　1.微量加样枪　　2.红血球计数板　　3.记号笔　　4.医用橡皮膏　　5.移液枪

（五）试剂　　1.D-Hanks液　　2.小牛血清　　3.培育液　　4.双抗（青霉素、链霉素）　　5.胰蛋白酶（0.08%）　　6.1NHCl　　7.7.4%NaHCO3　　8.DMSO（剖析纯）或无色新鲜甘油
二、操作过程

（一）细胞冻存

1.制造含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培育液；

2.取对数成长期的细胞，用胰蛋白酶把单层成长的细胞消化下来，悬浮成长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；

3.离心1000rpm，5min；

4.去掉胰蛋白酶及旧的培育液，参加适当制造好的冻存培育液，用吸管悄悄吹打使细胞均匀，计数，调理冻存液中细胞的Z终密度为5×106/ml～1×107/ml；

5.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；

6.在冻存管上标明细胞的称号，冻存时间及操作者；

7.冻存：规范的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/　　min；到-100℃时，则可敏捷浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中**，取出

冻存管，移入液氮容器内。

（二）细胞复苏

1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快消融。

2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培育液，混匀；

3.离心，1000rpm，5min；

4.弃去上清液，参加含10%小牛血清培育液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培育瓶，37℃培育箱静置培育；

5.次日更换一次培育液，持续培育。

三、注意事项

1．从增殖期到构成细密的单层细胞曾经的培育细胞都可以用于冻存，但Z好为对数成长期细胞。在冻存前一天Z好换一次培育液；　　

2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护作业，避免冻伤；　　

3．冻存和复苏Z好用新制造的培育液。

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