基因组学迈向蛋白质组学的桥梁

体外表达（一）：

前言
随着测序技术、PCR和RT-PCR技术、芯片技术和RNA干扰技术的突飞猛进，人们对核酸的信息了解得越来越多。可是，生命Z终是以蛋白质形式行使功能的，因此对蛋白质功能的研究才是生命科学真正的“重头戏”。对蛋白质功能的研究大体上有几个思路，其一：从DNA水平上敲掉它，或者在基因表达过程中沉默它（也就是我们常说的RNA干扰），看看缺失基因或者上调下调这个蛋白基因的表达水平对生命过程有何影响从而推测其功能，这类方法大多属于逆向思路；其二就是分离纯化蛋白质，研究其基本特性，直接在蛋白水平进行研究要完全掌握一个蛋白质，不要隔靴搔痒，这应该是必经的一步。我们甚至完全有理由相信，不远的将来，直接用纯化蛋白质转染细胞，在细胞水平上观察蛋白质对细胞的影响，也会成为类似RNA干扰一样重要研究工具，蛋白质干扰。由于蛋白质极为复杂的折叠和加工形式决定了不同蛋白的性质和活性存在极大的差异，蛋白质相比起核酸来说，无论制备、纯化、存储、操作都困难得多，因此目前大多数研究仍集中于核酸水平进行研究。但是，核酸研究Z终不可能取代蛋白质研究，随着科研水平不断的提高，直接对蛋白质进行研究必将成为大势所趋。率先把握未来的方向，就能快人一步！您开始准备了吗？生物通为您准备了大量的资料，一一讲解个中优劣。
“快”就一个字
以往，要获得蛋白样品，方法之一是通过收集大量的生物材料纯化。受限于材料的来源有太多的限制特别是人的组织来源，很多人转而采用另一种方法：重组表达的方式获得蛋白选择合适的表达系统，将DNA克隆到合适的表达载体中，通过转化或者转染到原核或者真核细胞中，筛选单克隆转化子，摸索表达条件进行优化。经过一番费时艰苦的工作并建立稳定的表达体系后，获得单克隆就可比较稳定地进行工业化生产。利用真核或原核细胞表达目的蛋白，Zda的困扰就是耗时：比如如何选择合适的表达系统由于表达外源蛋白必然会在不同程度上干扰细胞自身的代谢，不同的蛋白可能需要不同的表达载体和宿主细胞，以及需要摸索不同的表达条件和培养条件，否则可能表达不出结果。这个选择是非常令人头痛、费时费力的过程。随着蛋白质组学的发展，采用这种手段进行研究在速度上已经远远不能满足需要了。试想，当DNA纯化、PCR、克隆都已经可在96孔板或者384孔板上成批成批地高速度高通量自动化完成时，当一张小小的芯片已经可完成数以万计甚至更多的基因的检测的时候，却依然受限于一个一个基因的转化或者转染，然后在一个一个地筛选成功转化的转化子，摸索表达条件这就好比一条川流不息的高速公路上突然收窄为小小的独木桥！多郁闷啊！于是人们不得不开始寻找提速之旅。既然利用细胞表达有太多的因素干扰，无细胞体外表达就重新成为人们关注的目标。
体外表达早已有，本不算什么新鲜事儿。借助聚合酶体外转录PCR产物，可很简单高产地获得足量的mRNA，甚至戴上真核mRNA特有的“帽子”；加入特定的细胞裂解物，利用其中的核糖体、合成酶、tRNA、翻译起始、延伸、终止因子、氨基酸等等蛋白质合成的必需元件，在适合的温度下就可体外合成蛋白质。
相比之下，体外表达Zda的优势就是快与灵活方便如果你希望diyi时间鉴别基因产物、早出paper早毕业，而不是生产，干吗要浪费几个星期去建立一套表达系统呢？体外表达是更快速简单的选择，Z快只要几个小时就看到结果了。老实说，Z后究竟能有几个研究的表达体系有机会进入生产环节？何况实验室细胞株、培养发酵条件和工业相差还远呢！再说，就表达量而言，通常认为体外表达量低，如今不少体外表达体系已经可达到每毫升每小时反应体系数百微克的水平，媲美普通的哺乳动物表达系统，满足一般研究需要。
过去，传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质，今天，蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境(分子)的关系。蛋白质组学相关研究工具通常都是高通量、高度自动化的系统，速度快，配合相应分析软件和数据库，研究者可在Z短的时间内处理Z多的数据。体外表达Zda的优势就是快与灵活，由于突破了细胞的限制，整个实验可设计为自动化操作，甚至在不远的将来有可能进行高通量快速筛选，可说，体外表达是从高通量基因组研究迈向蛋白组研究的相当关键的一步。试想，从PCR到体外表达到蛋白纯化都可高通量进行，做起实验来该有多爽！
对比起体内表达，体外表达主要快在以下两个地方：
1可采用全PCR方式
体内表达往往都是需要将目的基因插入环状载体，或者是插入病毒载体，就算你实验室牛到感受态都不用自己做，还是要等细菌长个overnight，然后挑克隆鉴定。真核细胞就需要更长时间了。可是，利用体外表达，除了利用载体克隆，更快速的选择是你只要在PCR时两端加上不同的启动子序列就可得到体外表达的模版材料了。
2不利用细胞表达
利用细胞表达需要培养细胞、转化或者转染、挑选单克隆，还要培养细胞做表达。表达时由于影响的因素较多，需要摸索的条件也多。体外表达突破了细胞的限制，体外表达不需要花时间转化转染细胞、也不需要筛选重组克隆，也不需要培养细胞，只需几个小时就可得到产物，大大节约了时间和精力，在快速鉴别基因产物上就格外有优势。此外，体外表达还可避免过量表达对细胞的毒性，或者形成不溶的包含体，以及表达产物在细胞内的降解，因而可表达一些对细胞具有毒性的或者不稳定、容易被降解的蛋白。减少了蛋白变性复性的困扰。另外，体外表达还可在体系内添加特殊的修饰氨基酸或者标记氨基酸，非常灵活，因而在蛋白质折叠和蛋白质功能研究上都有重要应用。
从原则上来说，各种细胞都可制备成供体外表达用的细胞裂解物。在实际操作中，Z常用的3类体外表达系统都源自于需要GX合成蛋白质的细胞原核系统的大肠杆菌细胞裂解物，真核细胞的兔网织红细胞和麦胚细胞。要记住的是，真核体外表达体系并非只适用于真核基因，原核也并非只限于原核表达在灵活的体外表达系统中，只要序列满足启动子和核糖体结合位点的需求，任何系统均可匹配任何基因。生物通在后面特别介绍真核和原核体外表达的区别和几种不同的体外表达体系的区别。罗氏(Roche)、Promega等几家相当有远见的公司，一直致力于体外表达的研究开发，所以今天，我们也就有了更多种选择。

体外表达(二)：原理和技术要点
真核vs.原核
我们前面提到过，体外表达Z常用的3类体系是原核的大肠杆菌体系，真核的兔网织红细胞体系和麦胚细胞体系。对于无细胞的体外表达，任何基因，只要序列上满足启动子和核糖体结合位点的要求，就可用任一体系进行体外合成。3种不同选择，主要是为了满足优化的需要。在决定选择那种体系前，生物通带你首先来看看原核和真核的反应体系有哪些区别。

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