质粒提取纯化试剂盒的使用方法

生物柱离心式泰去内毒素超纯质粒小量抽提试剂盒说明书：washA,washB和washC:用前按照试剂瓶上标明的量分别加入分析纯异丙纯或95%的分析纯乙醇，充分混匀，用后盖紧盖子。

用1mlddH2O(灭菌)完全溶解rna酶，将RNA酶放入水中煮，水沸后再煮沸20分钟，关掉火，缓慢冷至室温后，将RNA酶取出，全部加入solutionI，充分混匀后，将solutionI放入4℃保存.

使用本试剂盒可从1—10ml过液培养菌液中抽提10—40ug超纯度质粒(OD260/OD280≈1.8)。所得到质粒dna可直接用于转染、测序、酶切、克隆等分子生物学操作。无需酚抽提、乙醇沉淀、CsCl离心。

实验步骤：

将菌液倒入1.5ml eppendorf 管，5000rmp离心5分钟，弃上清液，倒转管子在吸水纸上砸几下，将残余液体去除。votex，加入250ulsolutionI，votex充分混匀。

加入250ulsolutionII，缓慢颠倒4次混匀，室温放置5分钟。(注意：solutionII天冷时会沉淀，若发现溶液变得混浊，37℃溶化后再用)

加入350ulsolutionIIIB，立即缓慢颠倒4次混匀，室温放置5分钟。

13000rmp离心10分钟。

小心将上清750ul吸入到一新的1.5mleppendorf管(注意：不要将白色沉淀吸到1.5mleppendorf管中。若发现有白色沉淀吸到1.5mleppendorf管中，将1.5mleppendorf管中的液体重新13000rmp离心10分钟，将上请液重新吸入一新的1.5mleppendorf管中。)。

加入75ul(1/10体积)solutionIV,缓慢颠倒3次混匀。放入4℃30分钟，中间缓慢颠倒混匀2次。

13000rmp离心10分钟。

将结合柱放入2ml离心管，小心吸750ul上清液于吸附柱中(沉淀很小，注意不要吸到沉淀)，室温静置2分钟。

13000rmp离心1分钟，取出结合柱，弃2ml离心管中的废液，将结合柱再装入2ml离心管。

加入500ulwashA(用前加入分析纯异丙醇，充分混匀，用后盖紧盖子)于结合柱中，室温放置3分钟。13000rmp离心1分钟。弃2ml离心管中的废液。

将结合柱再装入2ml离心管中,加入650ulwashB(用前加入95%的分析纯乙醇，充分混匀，用后盖紧盖子)于结合柱中，13000rmp离心1分钟。弃2ml离心管中的废液。

将结合柱再装入2ml离心管中,加入500ulwashC(用前加入95%的分析纯乙醇，充分混匀，用后盖紧盖子)于结合柱中，13000rmp离心1分钟。

倒掉2ml离心管中的废液，将结合柱装入2ml离心管，13000rmp离心2分钟。

将结合柱装入一新的1.5mleppendorf管中(由于各厂家1.5mleppendorf管的口径不一致，管盖可能与结合柱的口径不匹配)，室温放置数分钟以确保乙醇挥发干净。在膜ZY小心加入50ulTE。不要戳破膜。室温放置2分钟。

13000rmp离心1分钟，1.5m离心管中即为抽提的去内毒素质粒DNA。

注意事项：

1.提高洗脱液的温度(65℃左右)或将结合柱于室温或37℃水浴静置1分钟以上，可提高DNA的得率。

2.不要在结合柱上做标记，以免乙醇将字迹褪掉。

3.所有试剂用后盖紧盖子.

4.solutionII天冷时会沉淀，若发现溶液变得混浊，37℃溶化后再用。

5.本试剂盒通常情况下采用1-1.5ml过液培养的菌体进行质粒抽提。若所培养的菌体浓度较低或质粒在宿主菌中的拷贝数较低，可适当增加起始菌体的量至5-10ml，同时SolutionI、SolutionII、solutionIIIB的用量相应扩大，但要确定比例关系为5：5：7，其他试剂用量不变。

6.起始菌体过量可能会导致抽提的质粒质量不好，如质粒的得率较低，存在RNA或蛋白污染等问题。下列现象可提示菌体过量：

加入SolutionII混匀并静置5min，溶液没有变成透明;或溶液虽然已变透明，但颠倒离心管时发现溶液很粘稠或不均匀。

加入SolutionIIIB后，有大块物生成，离心时很难将其离到管底。

7.本试剂盒中，所用吸附柱Zda容量为700μl，对双链DNA的Z适吸附量为20μg。若经过SolutionI、SolutionII、SolutionIIIB处理并离心后的上清体积超过700μl，可对同一吸附柱分批上样多次。

8.操作步骤2、3、4中，加入SolutionII、IIIB之后，应尽量小心温和混匀样品;若混和剧烈可能会导致Z后抽提出的质粒超螺旋解开或双链发生断裂。

可以根据质粒提取的量来选择质粒提取纯化试剂盒，例如大中小级别的；此外也可以根据提取质粒的使用用途来选择，转染级别，测序级等纯化试剂盒。上海心语生物科技有限公司推荐质粒纯化产品大全：凝胶纯化试剂盒，磁性的质粒纯化试剂盒，微孔板质粒纯化试剂盒，质粒纯化试剂盒（Mega），酵母质粒纯化试剂盒。