单个噬菌体插入区域的PCR扩增

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【导读】 [器材和试剂]● 一台PCR仪● P1atinunl（9PCRSupermix （Invitrogen）对于fUSE5的PCR● MilliQ纯水● 96孔反应管平...

[器材和试剂]● 一台PCR仪● P1atinunl（9PCRSupermix （Invitrogen）对于fUSE5的PCR● MilliQ纯水● 96孔反应管平板（Perkin—Elmer）fUSE5的PCR● fUSE5“正向”引物，一段有43个碱基的序列：5’—TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCTGATA AACCGATACAATT-3’（每个反应10pmol）。● fUSE5“超级反向” （SuperReverse）引物，一段有20个碱基的序列：5，—CCGTAACACTGAGTTTCGTC—3，（每个反应10pmol）。T7的PCR● T7“超级上游”（SuperUp）引物，一段有20个碱基的序列： AGCGGACCAGATTATCGCTA（每个反应 10pmol）。● T7“下游”引物，一段有20个碱基的序列： AAC CCC TCA AGA CCC GTTTA（每个反应10pmol）。 [方法]1．将一对引物溶于水，制备每个引物浓度为5pmol/ul（5umol/L）的溶液。2．将200pl5pmol/u1的引物溶液加到2．25ml（两个管）的PlatinumPCRSupermix中，制成PCR反应混合物。向96孔反应管平板的每个孔都加入24．5ul的PCR反应混合物。3．用一个无菌吸管尖挑取一个菌落（fUSE5）或噬菌斑（T7），并将其悬浮于10ul的1×TBS中。需将这10ul的悬液保留在其各自的96孔反应板中。当有必要扩增和检测单克隆时，这些板将成为每个单独噬菌体的来源。建议对这些噬菌体排序命名，这可以将序列数据与PCR反应板、Z终与对应的噬菌体板相对应。4．向每个24．5ul的PCR反应混合物中添加0．5ul的噬菌体或细菌悬液。5．采用以下条件来进行PCR反应：72℃放置10分钟；再于95℃放置5分钟；分别在3个温度下进行PCR，进行35次循环，条件分别是94℃下50秒、50℃下1分钟以及72℃下1分钟；再于72℃放置6分钟；Z后放置在4℃下直到准备测序为止。6．在2％～4％的琼脂糖凝胶上检测PCR反应的产物。

2004-07-19 09:04:13

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