Instant ELISA实验步骤人il-6 说明书

以humanIL-6instantELISA为例（cat#BMS213INST）

注意事项：

1.试验中使用特定试剂盒的标准品和抗体，不建议不同试剂盒产品调换，因为可能影响结果准确性。
2.稀释用的缓冲液中不能含有叠氮化钠，因为其可以灭活辣根过氧化物酶。
3.储存或孵育时避开强光。
4.注意人员防护，避免试剂接触皮肤。
5.底物溶液避免接触氧化剂和金属。
6.底物使用前请平衡至室温。
7.缓冲液稀释后有效期为一个月。

储存和稳定性说明
1.试剂盒提供冻结的标准品，对照干粉和平板，收到后请立即冻存于-20度冰箱，有效期见标签。
2.重复使用试剂请避免污染。

样品及收集注意事项
1.本试剂盒适用血清和细胞培养上清。
2.取血清时注意凝结后立即取出血清冻存于-20摄氏度一下，避免IL-6活性降低。
3.样品出现沉淀请离心去除，避免影响实验结果。
4.严重溶血或高血脂样品不能使用。
5.避免样品反复冻融，使用前平衡至室温，小心混匀。

实验材料：

1)预包被humanIL-6抗体的微孔板+结合生物素的检测抗体+抗生物素的辣根过氧化物酶。+HumanIL-6标准曲线。
2)25ml浓缩washbuffer20×。
3)12ml样品稀释液。
4)15mlTMB底物(四甲基联苯胺)。
5)15ml终止液：1MH3PO4或者2NH2SO4
6)Controlhigh一瓶（冻干粉）。
7)Controllow一瓶（冻干粉）。
8)封口膜。

仪器

吸管和单通或多通移液器
冰箱
排枪取液水槽
酶标仪
洗板机

准备试剂和样品
1)将浓缩洗液（20×）平衡至室温，稀释为1×。
2)Control干粉处理：加300ul双蒸水小心重悬干粉10~30min，使其完全溶解，使用前请小心混匀。按照CofA处理control范围，重悬后的液体储存于-20摄氏度，避免反复冻融。

实验流程：
注意：
★从-20℃冰箱取出板子后立即使用，防止变质。
★小心除去standard孔膜，是冻干粉沉在底部，避免膜带走干粉。
★加入双蒸水后无需等待其完全溶解即可进行下一步实验。
★严禁用TIP头混匀孔内溶液，因为会沾走试剂影响结果。
★400ul洗液洗板，洗涤除去孔壁粘附的残留物，以免影响实验结果。

1按照试验计划准备孔板A1/A2?~H1/H2（如表1）。

2按照标签所示，向standard和blank孔加入50ul（标签所示）双蒸水(A1/A2?~H1/H2)。
3向样品孔中加入100ul双蒸水。
4向样品孔加入样品25ul，包括复孔，小心混匀。
5封口膜封板，室温（1825摄氏度）孵育2小时，200rpm，震荡（若不震荡所得的OD值可能偏低，但是仍然可用）。
6弃掉液体，加400ul洗液，15s左右，弃掉排干，重复3次（避免孔过于干燥）。
7向各孔加TMB底物100ul，室温避光孵育10min，观察显色时间（标准品高浓度变为深蓝色或阳性对照不再有变化的时候）。
8迅速加入100ul终止液终止酶反应，2~8度避光1h内检测读板。

结果计算：（需要从标准品OD值拟合出来方程来推算样品的细胞因子的含量）。
1.计算标准品，空白和样品孔平均OD值。
2.样品OD值减去空白孔平均OD值。
3.利用软件拟合出4参数的对数标准曲线，也可以使用描点的方法在坐标中描绘出X轴为标准品浓度，Y轴为平均OD值的各个点，然后大致拟合出相应的曲线。佳的方法是使用回归分析的方法拟合出标准曲线。
4.利用标准曲线拟合的公式去计算样品中细胞因子的浓度。
5.如果在实验前样品经过稀释，则结果需要乘于稀释倍数。

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