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Instant ELISA实验步骤人il-6 说明书

来源:内容来源于网络 浏览量:289次
【导读】以humanIL-6instantELISA为例(cat#BMS213INST)注意事项:1.试验中使用特定试剂盒的标准品和抗体,不建议不同试剂盒产品调换,因为可能影响结果准确性。...

以humanIL-6instantELISA为例(cat#BMS213INST)

注意事项:

1.试验中使用特定试剂盒的标准品和抗体,不建议不同试剂盒产品调换,因为可能影响结果准确性。
2.稀释用的缓冲液中不能含有叠氮化钠,因为其可以灭活辣根过氧化物酶。
3.储存或孵育时避开强光。
4.注意人员防护,避免试剂接触皮肤。
5.底物溶液避免接触氧化剂和金属。
6.底物使用前请平衡至室温。
7.缓冲液稀释后有效期为一个月。

储存和稳定性说明
1.试剂盒提供冻结的标准品,对照干粉和平板,收到后请立即冻存于-20度冰箱,有效期见标签。
2.重复使用试剂请避免污染。

样品及收集注意事项
1.本试剂盒适用血清和细胞培养上清。
2.取血清时注意凝结后立即取出血清冻存于-20摄氏度一下,避免IL-6活性降低。
3.样品出现沉淀请离心去除,避免影响实验结果。
4.严重溶血或高血脂样品不能使用。
5.避免样品反复冻融,使用前平衡至室温,小心混匀。

实验材料:

1)预包被humanIL-6抗体的微孔板+结合生物素的检测抗体+抗生物素的辣根过氧化物酶。+HumanIL-6标准曲线。
2)25ml浓缩washbuffer20×。
3)12ml样品稀释液。
4)15mlTMB底物(四甲基联苯胺)。
5)15ml终止液:1MH3PO4或者2NH2SO4
6)Controlhigh一瓶(冻干粉)。
7)Controllow一瓶(冻干粉)。
8)封口膜。

仪器

吸管和单通或多通移液器
冰箱
排枪取液水槽
酶标仪
洗板机

准备试剂和样品
1)将浓缩洗液(20×)平衡至室温,稀释为1×。
2)Control干粉处理:加300ul双蒸水小心重悬干粉10~30min,使其完全溶解,使用前请小心混匀。按照CofA处理control范围,重悬后的液体储存于-20摄氏度,避免反复冻融。

实验流程:
注意:
★从-20℃冰箱取出板子后立即使用,防止变质。
★小心除去standard孔膜,是冻干粉沉在底部,避免膜带走干粉。
★加入双蒸水后无需等待其完全溶解即可进行下一步实验。
★严禁用TIP头混匀孔内溶液,因为会沾走试剂影响结果。
★400ul洗液洗板,洗涤除去孔壁粘附的残留物,以免影响实验结果。

1按照试验计划准备孔板A1/A2?~H1/H2(如表1)。

2按照标签所示,向standard和blank孔加入50ul(标签所示)双蒸水(A1/A2?~H1/H2)。
3向样品孔中加入100ul双蒸水。
4向样品孔加入样品25ul,包括复孔,小心混匀。
5封口膜封板,室温(1825摄氏度)孵育2小时,200rpm,震荡(若不震荡所得的OD值可能偏低,但是仍然可用)。
6弃掉液体,加400ul洗液,15s左右,弃掉排干,重复3次(避免孔过于干燥)。
7向各孔加TMB底物100ul,室温避光孵育10min,观察显色时间(标准品高浓度变为深蓝色或阳性对照不再有变化的时候)。
8迅速加入100ul终止液终止酶反应,2~8度避光1h内检测读板。

结果计算:(需要从标准品OD值拟合出来方程来推算样品的细胞因子的含量)。
1.计算标准品,空白和样品孔平均OD值。
2.样品OD值减去空白孔平均OD值。
3.利用软件拟合出4参数的对数标准曲线,也可以使用描点的方法在坐标中描绘出X轴为标准品浓度,Y轴为平均OD值的各个点,然后大致拟合出相应的曲线。佳的方法是使用回归分析的方法拟合出标准曲线。
4.利用标准曲线拟合的公式去计算样品中细胞因子的浓度。
5.如果在实验前样品经过稀释,则结果需要乘于稀释倍数。


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2018-11-08 09:23:03
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