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如何搞定干细胞的低温保存

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【导读】在过去十年里,多能干细胞成为了多个领域的实用工具,帮助人们探索发育生物学、研究疾病病理和开发细胞疗法。不论你用干细胞做什么研究,都离不开低温保存。冷冻可以保存珍贵的干细胞资源,不过...

在过去十年里,多能干细胞成为了多个领域的实用工具,帮助人们探索发育生物学、研究疾病病理和开发细胞疗法。

不论你用干细胞做什么研究,都离不开低温保存。冷冻可以保存珍贵的干细胞资源,不过冷冻干细胞可不像冷冻已分化细胞那么简单。我们不能简单沿用普通细胞的冷冻试剂和方案。
科学家们一开始对人胚胎干细胞进行操作时发现,一次冻融循环之后只有5%的细胞还具有多能性。这是因为压力条件会促使细胞发生分化,Fraunhofer细胞疗法和免疫研究所的AlexandraStolzing说,“如果保存的干细胞发生了随机分化,就没有价值了。"

另外,冷冻还会激活一个程序性死亡通路,而且在绝大多数情况下添加凋亡抑制剂收效甚微。科学家们一直在试图理解,低温究竟对多能干细胞产生了什么影响,希望在此基础上开发更好的冷冻方法,让更多细胞存活下来。
应该用什么来冷冻干细胞?这个问题的答案取决于你的细胞系,不过大多数成功的冷冻方案也有一些共同点。人们一般先用蛋白酶来解离细胞,然后进行离心,最后用含有冷冻保护剂的培养基重悬。经典的冷冻保存培养基,由90%的胎牛血清(FBS)和10%的DMSO组成,DMSO可帮助细胞抵御冷冻带来的有害影响。但是如果你的细胞要用于人体,上述试剂就不合适了,它们可能有毒会带来副作用。此外,使用90FBS/10DMSO混合物时,细胞复苏之后的活性往往较差。近来,研究者们纷纷开始使用无动物源成份的试剂,以及更低浓度的DMSO。Caspase抑制剂常被用来避免细胞凋亡。

今年早些时候,RIKEN发育生物学中心的TeruoAkuta等人比较了不同的低温保存方案和试剂,为自己的胚胎干细胞和诱导多能干细胞确定理想的培养基。他们发现,在冷冻前用链霉蛋白酶和螯和剂EDTA处理,可以提高干细胞的复苏率。Akuta指出,干细胞喜欢抱团生长,但冷冻保护剂难以浸透较大的细胞团块,用链霉蛋白酶和螯和剂EDTA可以将细胞分成大小均一的小簇。Akuta团队还改良了商业化的低温保护剂CP-1,CP-1含有淀粉(植物源的冷冻保护剂)和DMSO。他们通过添加人血清白蛋白和乙二醇,进一步提高了培养基的效力。研究显示,添加乙二醇时的复苏效率最高,有活力的细胞占到44%。不过,这样的组合并不一定适用于任何人。(延伸阅读:Science:iPS临床应用这次真的来了?)
“并没有所谓的最佳冷冻保护剂,"牛津大学的ZhanfengCui说。他建议新手们尝试不同试剂,查阅用到了相同细胞系的文献。许多人直接把细胞放在10%的DMSO里冷冻,然后等着出现好结果。“花几个小时查文献,就能为你节省大量的时间,"他指出。“培养干细胞是个高成本又费时的过程,我们要尽可能的保护资源。"

冷冻的速度重要么?绝大多数低温保存方案是,先将样本放在80°C冰箱,第二天再转移到液氮进行长期储存。有研究发现,使用程序性的冷冻方法能获得更好的结果。这种方法通过特殊设备,控制样本温度以稳定速度降低(每分钟几度)。不过就算你没有这样的设备也不必灰心,因为也有文章认为最终的细胞产量并没有太大差异。


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2018-11-08 09:23:03
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