如何搞定干细胞的低温保存

在过去十年里，多能干细胞成为了多个领域的实用工具，帮助人们探索发育生物学、研究疾病病理和开发细胞疗法。

不论你用干细胞做什么研究，都离不开低温保存。冷冻可以保存珍贵的干细胞资源，不过冷冻干细胞可不像冷冻已分化细胞那么简单。我们不能简单沿用普通细胞的冷冻试剂和方案。
科学家们一开始对人胚胎干细胞进行操作时发现，一次冻融循环之后只有5%的细胞还具有多能性。这是因为压力条件会促使细胞发生分化，Fraunhofer细胞疗法和免疫研究所的AlexandraStolzing说，“如果保存的干细胞发生了随机分化，就没有价值了。"

另外，冷冻还会激活一个程序性死亡通路，而且在绝大多数情况下添加凋亡YZ剂收效甚微。科学家们一直在试图理解，低温究竟对多能干细胞产生了什么影响，希望在此基础上开发更好的冷冻方法，让更多细胞存活下来。
应该用什么来冷冻干细胞？这个问题的答案取决于你的细胞系，不过大多数成功的冷冻方案也有一些共同点。人们一般先用蛋白酶来解离细胞，然后进行离心，Z后用含有冷冻保护剂的培养基重悬。经典的冷冻保存培养基，由90%的胎牛血清（FBS）和10%的DMSO组成，DMSO可帮助细胞抵御冷冻带来的有害影响。但是如果你的细胞要用于人体，上述试剂就不合适了，它们可能有毒会带来副作用。此外，使用90FBS/10DMSO混合物时，细胞复苏之后的活性往往较差。近来，研究者们纷纷开始使用无动物源成份的试剂，以及更低浓度的DMSO。CaspaseYZ剂常被用来避免细胞凋亡。

今年早些时候，RIKEN发育生物学ZX的TeruoAkuta等人比较了不同的低温保存方案和试剂，为自己的胚胎干细胞和诱导多能干细胞确定理想的培养基。他们发现，在冷冻前用链霉蛋白酶和螯和剂EDTA处理，可以提高干细胞的复苏率。Akuta指出，干细胞喜欢抱团生长，但冷冻保护剂难以浸透较大的细胞团块，用链霉蛋白酶和螯和剂EDTA可以将细胞分成大小均一的小簇。Akuta团队还改良了商业化的低温保护剂CP-1，CP-1含有淀粉（植物源的冷冻保护剂）和DMSO。他们通过添加人血清白蛋白和乙二醇，进一步提高了培养基的效力。研究显示，添加乙二醇时的复苏效率Zgao，有活力的细胞占到44%。不过，这样的组合并不一定适用于任何人。（延伸阅读：Science：iPS临床应用这次真的来了？）
“并没有所谓的Z佳冷冻保护剂，"牛津大学的ZhanfengCui说。他建议新手们尝试不同试剂，查阅用到了相同细胞系的文献。许多人直接把细胞放在10%的DMSO里冷冻，然后等着出现好结果。“花几个小时查文献，就能为你节省大量的时间，"他指出。“培养干细胞是个高成本又费时的过程，我们要尽可能的保护资源。"

冷冻的速度重要么？绝大多数低温保存方案是，先将样本放在80°C冰箱，第二天再转移到液氮进行长期储存。有研究发现，使用程序性的冷冻方法能获得更好的结果。这种方法通过特殊设备，控制样本温度以稳定速度降低（每分钟几度）。不过就算你没有这样的设备也不必灰心，因为也有文章认为Z终的细胞产量并没有太大差异。

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