- 探梦宇宙,阿美特克新一代【航天器太阳能阵列模拟器】隆重发布
- 探梦宇宙,阿美特克新一代【航天器太阳能阵列模拟器】隆重发布
- 梦想扬帆起,辉煌共铸成!加入 HORIBA 探索美好未来
- 再担重任,不负使命!HORIBA 加入小行星“贝努”样本分析团队
- 量子计量创未来!中国计量院深圳创新院与HORIBA共筑计量新时代
- 赫西仪器开展劳动法培训讲座
- 千眼狼恭祝《第九届全国青年燃烧学术会议》顺利召开
- 持续改进-助力焕新 贝克曼库尔特生命科学整体解决方案
- 环博会人气爆棚 &产品引领潮流!!!Day2
- 冷热台在低温介电性能测试中的应用
- 二十碳五烯酸乙酯(EPA-EE)的质量控制与杂质研究进展(附CATO全套杂质对照品清单)
- 二十碳五烯酸乙酯(EPA-EE)的质量控制与杂质研究进展(附CATO全套杂质对照品清单)
- 二十碳五烯酸乙酯(EPA-EE)的质量控制与杂质研究进展(附CATO全套杂质对照品清单)
- 来源:内容来源于网络 浏览量:509次
- 【导读】激酶活性分析蛋白激酶通常是多个信号转导网络的常见组分,它们影响了众多负责生物反应的下游效应物,因此,评估某个特定激酶的活性可能为平行通路提供宝贵信息。生物学样品中的激酶活性通常是在...
激酶活性分析
蛋白激酶通常是多个信号转导网络的常见组分,它们影响了众多负责生物反应的下游效应物,因此,评估某个特定激酶的活性可能为平行通路提供宝贵信息。生物学样品中的激酶活性通常是在体外测定的,在ATP的存在下将免疫沉淀的激酶与外源底物共同孵育。之后通过一些报告系统来评估特定激酶对底物的磷酸化,包括显色、放射性或荧光检测。此外,R&DSystems还提供非放射性的UniversalKinaseActivityKit,能够定量任何可产生ADP的激酶的活性。尽管我们能够获得有关特定激酶行为的信息,但评估细胞提取物中的酶活性仅仅揭开了信号通路的冰山一角。我们对蛋白如何被修饰还知之甚少,且体外活性分析也不能说明内源磷酸酶活性的潜在作用。磷酸化蛋白的直接检测可能为细胞如何应对外界刺激提供更详细的分析,因为磷酸化肽段的鉴定为蛋白的表达和功能状态提供信息。
磷酸化特异抗体的开发
直接测定蛋白磷酸化的一种经典方法是将整个细胞与放射性标记的32P-磷酸盐共同孵育,获得细胞提取物,通过SDS-PAGE分离,并曝光在胶片上。这种繁琐的方法需要多次几小时的孵育,且使用放射性同位素。其他传统方法包括2D凝胶电泳,这种技术假定磷酸化会改变蛋白的迁移率和等电点。
鉴于这些方法很费力,磷酸化依赖抗体的开发受到研究人员的极大欢迎。1981年,diyi个有记录的磷酸化抗体在兔子中产生,使用的是钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)的苯甲酰磷酸结合物。这一抗体广泛地识别了包含磷酸酪氨酸的蛋白。十年后,利用合成的磷酸化肽段来免疫兔子,开发出多个磷酸化状态特异抗体,这些磷酸化肽段代表了目标蛋白磷酸化位点周围的氨基酸序列。之后将免疫血清上样到肽段亲和柱中,产生高度特异的免疫试剂。磷酸化特异抗体的出现为传统方法的改进以及新的免疫分析技术的开发打开了大门。在任何技术中使用磷酸化特异抗体的忠告是,成功的检测依赖于抗体与目的磷酸化蛋白的特异性和亲和力。
westernBlot
Westernblot是评估蛋白磷酸化状态的Z常用方法,大部分细胞生物学实验室都拥有开展这些实验的设备。利用SDS-PAGE分离生物样品,随后转移到膜上(通常是PVDF或尼龙膜),之后利用磷酸化特异的抗体来鉴定目的蛋白。典型的Westernblot实验步骤避免了使用放射性同位素时的危险品和废物处理要求。许多磷酸化特异抗体十分灵敏,可轻松检测常规样品(如10-30g细胞提取物)中的磷酸化蛋白。由于测得的磷酸化蛋白水平可能随处理或凝胶上样误差而变化,研究人员常常利用一个抗体来检测同源蛋白的总水平(而不考虑磷酸化状态),以确定磷酸化组分相对于总组分的比例,并充当上样内对照。化学发光和显色法都很常用,而分子量marker常用来提供蛋白分子量的信息。详细的Westernblot实验步骤请看www.RnDSystems.com/go/WesternBlotProtocol。
酶联免疫吸附分析(ELISA)
ELISA已逐渐成为测定蛋白磷酸化的一种有力方法。ELISA的定量能力优于Westernblot,且在调节激酶活性和功能的研究中表现出巨大的作用。这种微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特异的捕获抗体,与磷酸化状态无关。随后让目的蛋白结合在抗体包被的分析板中,目的蛋白可以是纯的,也可以是复杂的异质样品(如细胞裂解液)中的一个组分。加入待分析的磷酸化位点特异的检测抗体。这些分析通常设计为显色或荧光检测。产生的信号强度与Z初样品中存在的磷酸化蛋白的浓度成正比。与更为传统的免疫印迹相比,磷酸化特异的ELISA技术具有一些优点。首先,利用经过校准的标准品,可轻松定量结果。其次,以三明治形式使用目的蛋白特异的两个抗体,带来了高的特异性。第三,ELISA的灵敏度更高允许使用更少量样品,检测低丰度的蛋白。Z后,微孔板形式的通量比传统的Westernblotting要高得多。ELISA通常带来了激酶活性的间接测定。不过,另一类ELISA技术使用固定化的捕获抗体、底物和磷酸化底物的检测方法,带来激酶活性的更直接测定。
基于细胞的ELISA
尽管体外生物化学激酶分析(如典型的三明治ELISA)常用于假说检验和药物筛选,但它们无法复制细胞内的环境。分析完整细胞内的蛋白磷酸化也许能更准确地代表特定信号通路网络的状态。一些免疫分析Z近被开发出来,能够在完整细胞的背景下测定蛋白磷酸化。细胞在同一个孔中被刺激、固定和阻断。使用磷酸化特异抗体,利用荧光或显色检测系统来评估磷酸化状态。此外,在微孔板的同一个孔中同时检测磷酸化蛋白和总蛋白。因此,来自目的蛋白的信号可通过第二种蛋白来标准化,校正各孔之间的差异,实现磷酸化蛋白水平的准确评估,并比较多个样品,与传统免疫印迹中使用磷酸化特异和总蛋白抗体相似。这些分析绕过了制备细胞裂解液的需要,因此更适合高通量分析。
细胞内流式细胞术和ICC/IHC
传统的细胞内流式细胞术和免疫细胞化学/免疫组织化学(ICC/IHC)是检测磷酸化事件的有力工具。流式细胞仪利用激光来激发用于抗体检测的荧光染料。在评估同一个细胞中的多个蛋白时,必须精心选择滤光片组合和荧光染料,其光谱不能重叠。流式细胞术很有优势,因其实现了快速、定量的单细胞分析。通过细胞表面标志的分型可检测异质群体中特定细胞类型的蛋白,而无需在物理上分离细胞。通过这种方法可分析稀有的细胞群体,而不用担心细胞损失或细胞分选过程中可能发生的蛋白表达变化。
ICC通常指的是利用显微镜对培养细胞中的蛋白进行检测,而IHC指的是对完整组织切片中的蛋白进行检测。与流式细胞术相似,这些技术实现了细胞或组织内多个蛋白的评估,只是要足够重视,避免荧光光谱或颜色的重叠。荧光和显色检测技术都经常使用。与监控磷酸化的其他形式不同,ICC通常是确定细胞内定位的shou选方法。流式细胞术和ICC/IHC都需要高亲和力、高特异性的抗体、阻断步骤、对照和抗体滴定,以避免因非特异性结合而带来的不明确结果。
通过流式细胞术和ICC来检测磷酸化蛋白要求蛋白是稳定的,且抗体能够接近。细胞通常经过刺激,并由甲醛或多聚甲醛固定,以交联磷酸化蛋白,使其稳定,便于分析。固定后的细胞必须经过透化处理,让磷酸化特异抗体可进入细胞。对于不同的亚细胞定位,通常使用不同的透化技术。温和的去垢剂可实现细胞质蛋白的检测,而抗体要想接近核蛋白,可能需要使用酒精。酒精透化也可增强磷酸化特异抗体的磷酸化蛋白检测,因酒精具有变性的特点。关于更详细的ICC/IHC实验步骤,请访问:www.RnDSystems.com/go/IHCProtocol。
质谱
复杂的生物样品(如细胞裂解液)中蛋白质磷酸化的全面评估(磷酸化蛋白质组学)对于了解基于磷酸化的信号网络很重要。复杂的蛋白混合物中大规模的磷酸化蛋白分析包括磷酸化蛋白和磷酸化肽段的鉴定,以及磷酸化残基的测序。质谱(MS)技术是完成这些任务的有用工具。尽管质谱在鉴定单个蛋白上具有出色的灵敏度和分辨率,但对于磷酸化蛋白的分析,还有一些固有的困难。首先,磷酸化肽段的信号通常较弱,因为它们带负电荷,而电喷雾质谱在正电模式下作用,因此电离效果不好。其次,在大量非磷酸化蛋白的高背景之下,很难观察到低丰度目的蛋白的信号。为了克服这些缺点,人们已经开发出一些富集策略,包括固定化金属亲和层析(IMAC)、磷酸化特异抗体富集、化学修饰法(如磷酸化丝氨酸和苏氨酸的β-消去反应),以及用生物素化的基团取代磷酸基团。
多个分析物图谱分析
质谱技术如碰撞诱导解离(CID)和电子转移解离(ETD),提供了肽段序列和翻译后修饰(磷酸化)的全面平行分析。这些技术相当费力,而当特定通路作为主要研究目标时,可能不需要全面的磷酸化分析策略。这导致一些同时测定多个分析物的蛋白磷酸化的新方法被开发出来。总的来说,这些方法涉及到磷酸化特异抗体的使用,包括基于微孔板、磁珠和膜,基于磁珠和基于膜的检测形式。这些分析Z明显的好处在于通量能力被大大提高,避免了运行多个Westernblot或传统的ELISA分析的需要。这些技术也能够提供更多的数据,而所需的样品量极少。相应地,蛋白图谱分析通常被认为灵敏度不及传统的对应技术,因潜在的抗体交叉反应性。
磷酸化蛋白多重分析
新的基于微孔板的ProteomeProfiler96PhosphoAntibodyArrays
特点
高达16个分析物/孔
3小时的快速分析时间
低的样品量要求
化学发光和近红外检测
易于高通量
结论
评估蛋白磷酸化往往是细胞生物学家保留曲目中必不可少的一部分,可了解引起细胞活性的细胞内因子。考虑到激酶扮演的重要角色,研究人员必须要有优质的工具,才能测定蛋白磷酸化和/或激酶活性。每种技术在不同的背景下发挥优势,因此必须精心挑选Z适合实验设计的方法(表1)。这篇综述简要介绍了一些评估蛋白磷酸化的Z常用方法。由于需求在不断增长,方法也在不断改善,让研究人员能够更深入地了解这些复杂而重要的过程,Z终控制细胞功能。
仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。
相关热词:
等离子清洗机,反应釜,旋转蒸发仪,高精度温湿度计,露点仪,高效液相色谱仪价格,霉菌试验箱,跌落试验台,离子色谱仪价格,噪声计,高压灭菌器,集菌仪,接地电阻测试仪型号,柱温箱,旋涡混合仪,电热套,场强仪万能材料试验机价格,洗瓶机,匀浆机,耐候试验箱,熔融指数仪,透射电子显微镜。
- 2004-11-08 09:23:03
- 标签:
- 收藏(0) 赞(0) 踩(0)
- 随时了解更多仪器资讯,求购、招标、中标信息实时更新,厂商招商信息随时看。大量、齐全、专业的仪器信息尽在仪器网(yiqi.com)。扫一扫关注仪器网官方微信,随时随地查看仪器用户采购、招标需求!
-
ELISA试剂盒操作方法及步骤2004-07-16 10:28:52
ELISA试剂盒操作方法及步骤上海心语生物科技有限公司酶联免疫分析试剂
-
小量组织的蛋白质组及磷酸化蛋白质组定量分析2004-07-05 09:14:03
在这篇工作中,我们采用内标掺入 SILAC 的定量方法对大鼠胰岛进行了蛋白质组以及磷酸化蛋白质组的定量研
-
基于二氧化钛富集策略的人类磷酸化蛋白质组大规模鉴定2004-07-05 09:14:03
在这部分工作中,我们采用了高 pH 反相色谱结合二氧化钛富集以及二氧化钛富集结合强阳离子交换分级两条技术
-
接种环灭菌器的使用方法及其注意事项2004-07-06 08:51:50
接种环灭菌器的使用方法及其注意事项 实验室中常用到的红外接种环灭菌器火焰加热或灼烧灭菌装置有酒精灯、
-
TC4与TA2在实验室反应釜中使用的优缺点比较2004-07-06 08:51:52
主要介绍TC4及TA2在实验室反应釜制造中的相同点及优缺点TC4为钛合金,TA2为纯钛,这两种材质在实验室反
-
恒温振荡器操作方法及维护保养2004-07-09 09:55:17
恒温振荡器操作方法及维护保养 恒温振荡器(又称空气恒温摇床),是一种温度可控的 恒温培养箱和振荡器相结合的
-
顶空进样器都有哪些以及其优缺点(二)2004-07-09 09:55:18
顶空进样器都有哪些以及其优缺点(二)顶空进样器分为全自动顶空进样器和自动顶空进样器两大类自动顶空进样器型号介
-
顶空进样器都有哪些以及其优缺点(一)2004-07-09 09:55:18
顶空进样器都有哪些以及其优缺点(一)顶空进样器分为全自动顶空进样器和自动顶空进样器两大类全自动顶空进样器型号
-
全自动旋光仪的使用方法及维护2004-07-09 09:55:19
全自动旋光仪的使用方法及维护一、旋光仪构造部件及配件耗材:1.光源2.毛玻璃3.聚光镜4.滤色镜5.起偏
-
生化培养箱使用方法及注意事项详解2004-07-09 09:55:21
生化培养箱是一种常用的实验设备,具有制冷和加热双向调温系统,温度可控的功能,广泛应用于低温恒温试验、培养试
检测蛋白磷酸化的六种方法及其优缺点
-
您可能感兴趣
①本文由仪器网入驻的作者或注册的会员撰写并发布,观点仅代表作者本人,不代表仪器网立场。若内容侵犯到您的合法权益,请及时告诉,我们立即通知作者,并马上删除。
②凡本网注明"来源:仪器网"的所有作品,版权均属于仪器网,转载时须经本网同意,并请注明仪器网(www.yiqi.com)。
③本网转载并注明来源的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品来源,并自负版权等法律责任。
④若本站内容侵犯到您的合法权益,请及时告诉,我们马上修改或删除。邮箱:hezou_yiqi