质粒提取原理及流程

质粒提取
质粒提取试剂盒简介：质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不
等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
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较常用的质粒DNA提取方法有3种：碱裂解法、煮沸法和去污剂(如Triton和SDS)裂解法。前两种方法比较剧烈，适用于较小的质粒(<15kb)。去污剂裂解法则比较温和，一般用于分离大质粒(>15kb)。碱裂解法是一种应用为广泛的制备质粒DNA的方法，其原理为：染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性时即恢复其天然构象；变性染色体DNA的片段与变性蛋白质和细胞
碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，离心去除沉淀后，就可从上清中回收质粒DNA。目前，市面上质粒提取试剂盒大多数都是采取上述的碱裂解方法，
不同之处在于纯化方式。目前比较常用的纯化系统是硅基质吸附材料，其原理为在高盐环境下质粒DNA能够结合到硅基质上，然后用低盐缓冲液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱下来。得到的质粒可以用于酶切、PCR、测序、细菌转化、转染等分子生物学实验。
影响质粒提取的因素：
质粒提取的得率和质量与很多因素有关，如宿主菌的种类和培养条件、细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素、吸附柱的吸附量等。
宿主菌种类
质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，多数情况下我们是从大肠杆菌中提取质粒。大肠杆菌的菌株不同会影响质粒提取的质量。从宿主菌如DH5α和T*P10中可以得到高质量的质粒DNA。HBl01和它的衍生菌株，如TG1和JM系列会在裂解时产生大量的糖类，如果没有完全去除，将YZ后续实验中的酶活性，影响质粒DNA提取的质量。另外，有些菌株有非常高的内切酶活性，会降低
DNA的得率。因此推荐使用DH5α和T*P10来提取质粒DNA。培养时间从固体培养基平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(含有相关抗生素的液体培养基中)，振荡培养12-16小时。不应超过16小时，因为这时细胞开始裂解，使得质粒的得率降低，也会导致质粒丢失或质粒变异。
质粒扩增
氯霉素能YZ宿主细胞蛋白质和DNA的合成，但对松弛型质粒的复制没有影响。因此，在细菌培养液中加入氯霉素可提高松弛型质粒的拷贝数。由于氯霉素YZ了宿主细胞蛋白质和DNA的合成，从而YZ了染色体的复制，但质粒复制所用的酶半衰期较长，故质粒仍可继续复制，这样既可增加质粒产量，又可降低细胞的数量，使细菌裂解液的粘度降低而便于操作。常用于扩增的氯霉素浓度为170ug/ml。
抗生素
在菌株的各生长阶段都应加入抗生素筛选。现在用的许多质粒都不含有在细胞分裂时确保平均分配的par位点，无质粒的子细胞在无抗生素时复制速度远大于含质粒的细胞。
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