ECL发光液使用说明

ECL显色原理：鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。

产品描述：

ECL化学发光超敏显色试剂盒用于检测直接或间接标记辣根过氧化物酶（HRP）的抗体及其关联的抗原。其原理是，蛋白质或核酸在电泳后转移到印迹膜上，以一抗及HRP标记的二抗结合膜上的目的蛋白，或以HRP标记的探针直接或间接结合膜上的核酸。洗膜后用本产品配制的ECL工作液，室温孵育膜数分钟，将印迹膜用保鲜膜包被粘贴固定于X光片曝光暗盒。然后转入暗室将X光胶片压在膜上曝光数秒到数小时，显影定影后蛋白质或核酸条带可清晰显示在X光胶片上。

采用独特的发光底物系统，降低曝光背景的同时引入新型的氧化剂，大大提高试剂盒的稳定性，使其在室温能稳定放置一年。除用于X光片，还可直接使用荧光CCD扫描，主要用于WB检测以及化学发光免疫检测系统。

优势:

●极高灵敏度：可检测低至10-100pg级的抗原

●极高信噪比：优化配方，背景很低

●极高性价比：节省一抗和二抗，缩短实验周期，降低经济和时间成本

●极高稳定性：持续发光时间长，4℃条件下保存时间可达6个月以上

●可对X光胶片曝光，也可直接进行luminometer检测或者荧光CCD扫描。

试验步骤：

1.执行常规电泳、转膜、HRP标记抗体或者HRP标记核酸探针孵育、洗膜。常温操作即可。

【注】：ECL发光液是HRP的显色底物，因此检测系统Z终必须基于HRP酶标记抗体或者核酸探针。

2.Z后一次洗膜的同时，新鲜配制发光工作液：分别取等体积的A液和B液1：1混合，混匀后，室温放置备用。

【注】：取A液和B液一定要用不同的枪头；另建议立即使用工作液，室温放置数小时后仍可使用但灵敏度略有降低。（100~200μl发光工作液/cm2膜）

3.用平头镊取出膜，膜的下缘轻触在滤纸上除去多余洗液（勿使膜完全干燥）。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育1-3分钟，准备立即压片曝光。

【注】：孵育时间过长不会增加灵敏度，有时还会导致曝光条带异常。发光过程的本质是酶促反应，使用过少的发光工作液不利反应进行，也会导致膜上条带曝光不均和明显降低灵敏度。为达节约目的可将膜剪小，但勿降低发光液使用比例。

4.用平头镊子夹起膜，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体，留下少量工作液，不可让膜完全干燥。

5.将膜迅速包裹于洁净的保鲜膜里，去除气泡和皱褶，用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖印迹膜的保鲜膜固定在暗盒内，蛋白带面向上。

6.暗房内取一张X光胶片至于包裹的膜上，压片，分别曝光不同的时间，如数秒到数分钟，定影显影冲洗。

【注】：曝光时间需根据曝光强度做相应的调整。若是背景过高，可使用两张X光胶片同时压片。

注意事项：

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）步骤1～5可在日光灯下操作；但发光液曝露于强光下时间过久灵敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免。戴手套可以避免在膜上留下手印，保持膜的干净。

3）长时间曝光或蛋白过量，将加深背景并使条带强弱变化失去线性关系。曝光不足则条带模糊。

4）发光工作液孵育约3分钟后膜上的条带发光。强条带发光在暗房中肉眼可见，低丰度蛋白条带发光较弱甚至肉眼不可见但可使X光胶片曝光。不能简单以肉眼观察判断条带发光时间。肉眼不可见的荧光实际上可持续数小时并使X光胶片感光，因此弱带可曝光1-10小时。如果曝光后条带不佳，可用洗膜缓冲液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL发光和曝光。

5）由于发光液灵敏度高，抗体浓度过高将造成高背景或没有条带，导致失败，所以要适度优化抗体浓度。

6）某些保鲜膜包裹印迹膜时可能会淬灭荧光，应选择高质量保鲜膜。

7）避免将多张膜置于同一个洗膜盒内洗膜，相互吸附或摩擦可能造成很深的背景。

8）使用肉眼可见的预染色蛋白Marker和荧光-放射自显影曝光标签可精确确定胶片上条带的位置和大小。

9）使用生物素-亲和素系统，避免使用牛奶封闭，可能会导致背景过高。

10）金属氧化物颗粒可能会造成膜上出现颗粒状斑点，避免使用带有锈迹的剪刀以及镊子，建议使用塑料的平头镊子。

11）叠氮化钠（NaN3）能YZHRP活性，若回收HRP标记探针或者抗体应避免使用NaN3，如必需使用勿超过0.01%。

12）本品无特殊毒性，按普通化学品处理。

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