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上海长方光学仪器有限公司

胚胎干细胞培养标准化操作规程

来源:内容来源于网络 浏览量:1267次
【导读】一般培养维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有ESGRO(白血病抑制因子)的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1%明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2-3天从...

一般培养维持ES细胞处于未分化状态
ES细胞培养用含有ESGRO(白血病YZ因子)的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1%明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2-3天从达到80%-90%融合的平板按1:8的比率传代细胞一次,细胞传代以后,在将细胞接种在0.1%明胶包被的培养皿之前,通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时,使分化细胞粘附,从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃,5%CO2,100%湿度条件下培养。


培养基
ES:
配制一20×不含DMEM,HS,ESGRO的溶液(该溶液也能用于EB培养基--见下文)。分装在50mlFALCON管中,(稀释为2×,每管42ml),贮存在-20℃。通过将21ml该溶液,HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基,0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。注:一瓶DMEM是500ml。

贮存液
DMEM(高糖)
马血清(HS)
L-谷氨酰胺(200mM)
MEMNEAA(10mM)
HEPES(1M)
β-巯基乙醇(55Mm)
PEST
ESGRO

复苏细胞
细胞被冻存在10%二甲基亚砜(DMSO)中防止结晶的形成,结晶的形成会损害细胞。然而,二甲基亚砜对细胞有毒性,快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤:
1.从液氮中取出一管细胞;
2.将冻存管置于37℃水浴中2分钟(或放到管内溶液恰好完全溶解);
3.将细胞转移到一15mlFalcon管中;
4.加入5mlES培养基(用培养基冲洗冻存管);
5.离心3分钟;
6.弃上清,用2mlES培养基重悬细胞,至少吹打10次;
7.接种在明胶包被(见下文)的6孔或6cm组织培养皿;
8.孵育。

冻存细胞
冻存液
90%HS和10%二甲基亚砜

步骤:
1.1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内;
2.用细胞刮刀收集细胞;
3.将细胞转入15mlFalcon管内并离心3分钟;
4.弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中(10cm的培养皿用2ml,15cm的培养皿用6-7ml。)
5.分装于冻存管内,每管1ml;
6.置-80℃过夜,第二天移入液氮。

明胶包被
准备500ml0.1%明胶溶液
1.将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中(50-65℃水浴15~30分钟)。
2.Z好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤,贮存在4℃。
包被培养板或培养皿
1.加入足量的明胶溶液覆盖培养平面(15cm培养皿加2ml,10cm培养皿加0.5~1ml,溶液的量并不重要,只要能完全覆盖培养表面就行了。);
2.置室温30分钟;
3.去除明胶溶液,将培养板贮存在包装袋中室温放置,Z好将板子平方,以免明胶污染盖子和流出培养板。


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2004-08-30 09:23:16
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