二代测序快速DNA建库试剂盒（Illumina）说明书

NGSFastDNALibraryPrepSet

forIllumina

目录号：YJ2585

运输条件：干冰运输。

保存条件：-20℃保存。

组分说明

Size102496

EndPrepEnzymeMix20μl48μl192μl

10xEndRepairReactionBuffer80μl200μl800μl

T4DNAligase20μl48μl192μl

T4DNAligaseBuffer160μl400μl2×800μl

HiFidelity2×PCRMasterMix250μl600μl2×1.2ml

本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途

产品简介

　　本试剂盒提供了DNA文库构建所需要的酶预混体系及反应缓冲液，包含除接头与

PCR引物外的所有成分，用于illumina二代测序平台DNA文库构建。和一般建库方法相

比，该试剂盒操作简单、方便，极大地缩短了文库构建时间。另外，试剂盒采用高保

真DNA聚合酶进行文库富集，无偏好的PCR扩增，扩大了序列的覆盖区域，可GX制

备用于illumina二代测序平台的DNA文库。试剂盒中提供的所有试剂都经过严格的质量

控制和功能验证，Zda程度上保证了文库构建的稳定性。

产品特点

末端补平，磷酸化，加A一步完成。

不需纯化，直接加接头。

超保真扩增，Zda程度上降低了扩增偏好性。

支持多种样本，且所得文库能够用于IlluminaGAIIx，HiSacnSQ、HiSeq2500/2000

/1000和MiSeqsequencing等测序平台的测序。

自备仪器、试剂和耗材

1．磁力架：建议使用DynaMagTM-2

(Cat.No.12321D)。

2．DNA纯化回收试剂盒：建议使用康为磁珠法DNA纯化回收试剂盒(Cat.No.YJ2508)。

3．样本接头引物试剂盒：建议使用康为二代测序多样本接头引物试剂盒I/II(Cat.No.

YJ2586/YJ2587）。

4．无水乙醇，EB(10mMTris-HCl,pH8.0)，去离子水（pH在7.0-8.0之间）。

5．反应管：建议使用低吸附的PCR管与1.5ml离心管；

枪头：建议使用高质量过滤枪头防止试剂盒、文库样本污染。

实验前准备及重要注意事项

1．避免试剂的反复冻融。

2．PCR产物因操作不当极易产生污染，导致实验结果不准确，建议将PCR反应体系配

制区与PCR产物纯化区隔离，并使用专门的移液器，定时对各实验区域进行清洁。

DNA建库流程示意图

2小时40分钟得到DNA文库

1.DNA末端修复（~50min）

2.Adaptor连接（~15min）

3.连接adaptor后的DNA片段的选择性回收

4.PCR扩增（~15min）

5.PCR产物纯化（30min）

补平、磷酸化、加A一步完成

两步操作一管完成

操作步骤

样本要求：5ng-1μg打断的双链DNA，溶于EB（10mMTris-HClpH8.0)或去离子水中。

DNA纯度要求：OD260/OD280=1.8~2.0。

DNA末端修复反应

1．向200μlPCR管中加入以下试剂：

试剂名称体积

10xEndRepairReactionBuffer6.5μl

EndPrepEnzymeMix2μl

fragmentedDNAX（5ng-1μg）

RNase-freeWaterUpto65μl

2．用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀，短暂离心,使所有组分收集到管底。

3．将上述PCR管置于PCR仪中，热盖打开，反应程序如下：

15min@12℃

15min@37℃

20min@72℃

Holdon4℃

Adaptor连接

建议使用康为adaptor进行连接，也可选择使用NEB、illumina公司的adaptor，具体连接方

法可参考各公司的产品使用说明书。以下为使用康为adaptor进行连接的操作步骤：

1．向上述已完成DNA末端修复的反应液中直接加入以下试剂：

试剂名称体积

T4DNAligasebufferforillumina14μl

T4DNAligase2μl

Adaptor2.5μl

此时管中溶液总体积为83.5μl。

注意：若起始样本量少于100ng，请将adaptor用去离子水稀释10倍至1.5μM后使用。

2．用枪头将上述试剂吹吸混匀，短暂离心，使溶液收集到管底。

3．20℃温浴15分钟。

注意：若此操作使用pcr仪，请将热盖关闭。

DNA片段的选择性回收

建议使用上海研谨磁珠法DNA纯化回收试剂盒（YJ2508）进行DNA片段选择性回收。

注意：DNA片段选择性回收是可选步骤，若起始样本量低于50ng，不建议进行DNA片

段选择性回收，可参考说明书第4页，直接进行DNA片段的纯化。另外构建不同大小的

DNA文库时，DNA片段选择性回收的磁珠使用量不同，具体磁珠用量可参照附表1（若

使用除康为以外厂家的磁珠，需自行摸索Z佳磁珠用量）。

以下操作步骤中，可选择回收DNA片段长度峰值为320bp（插入片段长度200bp），反

应起始体积为100μl。

1．涡旋振荡CMPure20秒，使其彻底混匀为均一溶液。

2．向连接反应液中加入16.5μl去离子水，使adaptor连接反应缓冲液体积至100μl。

注意：若使用NEBadaptor，只需要加入13.5μl去离子水。

3．将上述adaptor反应缓冲液转移至一新的1.5ml离心管中。

4．加入60μl混合均匀的CMPure，涡旋震荡5秒钟后,室温静置5分钟。

5．短暂离心，将离心管置于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清（约需5

分钟），小心地将上清溶液转移至新的1.5ml离心管中,并弃去磁珠。

注意：不要弃除上清。

6．向上清中加入20μl混合均匀的CMPure，涡旋震荡5秒钟后室温放置5分钟。

7．短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清（约需5

分钟），小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。

注意：不要弃除磁珠。

8．继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μl新配置的80%乙醇，室温放

置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。

9．重复步骤8。

10.保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。

11.将离心管从磁力架上取下，加入28μl10mMTris-HCl（pH8.0）或去离子水（自

备），涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。

12.短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清（约需5分钟），将23μl洗脱液转

移至一个新的PCR管中；

注意：一定不要转移磁珠，微量磁珠污染可影响后续PCR反应的正常进行。

另一种方案：DNA片段的纯化

1．涡旋振荡CMPure20秒，使其彻底混匀为均一溶液。

2．将adaptor连接反应液转移至一新的1.5ml离心管中。

3．加入1倍样品体积的CMPure，涡旋震荡5秒钟后，室温静置5分钟。

4．短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清（约需

5分钟），小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。

注意：不要弃除磁珠。

5．继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μl新鲜配置的80%乙醇，室

温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。

6．重复步骤5。

7．保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。

8．将离心管从磁力架上取下，加入28μlEB（自备）或去离子水，涡旋振荡使磁珠完

全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。

9．短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清（约需5分钟），将23μl洗脱液转

移至一个新的PCR管中。

PCR扩增

1．在PCR管中加入以下试剂并混匀。

试剂名称体积

连接adaptor后的DNA片段23μl

HiFidelity2XPCRMasterMix25μl

Univesialprimer1μl

Indexprimer1μl

总体积50μl

2．PCR反应条件。

步骤温度时间

预变性98℃30s

变性98℃10s

退火65℃30s6-16个循环

延伸72℃30s

终延伸72℃5min

注意：建议1μg样本起始量时PCR循环数为6个循环，50ng时10个循环，5ng时14-15个循环，PCR循环数也可根据实验需要进行优化。

PCR产物的纯化

1．涡旋振荡CMPure20秒，使其彻底混匀为均一溶液。

2．将PCR反应液转移至一新的1.5ml离心管中。

3．加入1倍样品体积的CMPure，涡旋震荡5秒钟后室温静置5分钟。

4．短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清（约需

5分钟）。小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。

注意：不要弃除磁珠。

5．继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μl新鲜配置的80%乙醇，室

温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。

6．重复步骤5。

7．保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。

8．将离心管从磁力架上取下，加入30μlEB（自备）或去离子水，涡旋振荡使磁珠完全

重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。

9．短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清（约需5分钟），将洗脱液转移至一

个新的PCR管中约25μl，DNA文库在-20℃保存。

文库质量检测

文库浓度

为了得到高质量的测序结果，需要对DNA文库进行精确定量，首先推荐使用Real-time

PCR方法对DNA文库进行定量。此外，还可使用荧光染料法，如Qubit法或荧光染

料picogreen法，此处请勿使用基于吸光度测量的定量方法。Z终可使用以下近似公式

换算DNA文库的摩尔浓度。

文库平均总长度近似转换公式成簇反应DNA文库浓度

200bp1ng/μl=7.5nM6-12pM

300bp1ng/μl=5.0nM6-12pM

400bp1ng/μl=3.8nM6-12pM

500bp1ng/μl=3.0nM6-12pM

文库长度分布

制备好的DNA文库可用琼脂糖凝胶电泳或Agilent2100Bioanalyzer检测DNA文库中的片

段长度分布范围。

LS

图1：Agilent2100Bioanalyzer文库分析结果

L：DNALadder；

S：使用200ng人基因组DNA构建文库，磁珠进行选择回收后结果。

文库结构

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCC

GATCT[TargetSequence]TGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNN

NNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’

NNNNNN：index,6bases

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