HiFi-MMLV一步法RT-PCR试剂盒说明书

HiFi-MMLVOneStepRT-PCRKit

HiFi-MMLV一步法RT-PCR试剂盒

目录号：YJ0745

保存条件：-20℃保存。

组分说明

Cat.No.YJ0745

KitSize100

HiFi-MMLVOneStepRT-PCREnzymeMix50μl

2×OneStepRT-PCRBuffer1.4ml

RNase-FreeWater1ml

本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途

产品简介

　　本试剂盒是专为一步法RT-PCR实验研制，逆转录和PCR在同一反应体系中进行，

反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，在避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验

效率。本试剂盒包括逆转录酶、快速热启动DNA聚合酶，同时包含适用于逆转录和

PCR扩增的反应缓冲液和实验中所必需的反应组分。HiFi-MMLV逆转录酶RNaseH活性

缺失，减少了逆转录反应中RNA的降解。HiFi-MMLV逆转录酶热稳定性强，可获得高产

量的cDNA。PCR反应使用的快速热启动DNA聚合酶具有扩增效率高、延伸速度快的优

良性能。独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥Zda功效。使用本试剂盒扩增得

到的目的产物3′端附有一个″A″碱基，可直接用于T/A克隆。

注意事项

1．在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门

的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经

常更换手套。

2．实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙

酯）水溶液在37℃处理12小时，并在120℃下高压灭菌30分钟后使用，或者将玻璃

器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用0.1%的DEPC

处理后进行高压灭菌。

3．本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心

后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。

4．本试剂盒必须使用特异性引物，引物的选择可根据具体实验来选择，引物设计的好

坏直接影响到RT-PCR反应的结果，设计引物时需考虑GC含量，引物长度，引物

位置，PCR产物的二级结构等因素，建议采用专业的引物设计软件来设计。

使用方法

1．将RNA模板、引物、OneStepRT-PCRBuffer、OneStepRT-PCREnzymeMix

和RNase-FreeWater溶解并置于冰上备用。

2．根据以下表格配制反应体系：

试剂25μl反应体系终浓度

2×OneStepRT-PCRBuffer12.5μl1×

ForwardPrimer，10μM1μl0.4μM

ReversePrimer，10μM1μl0.4μM

HiFi-MMLVOneStepRT-PCREnzymeMix0.5μl

RNATemplateXμl10pg1μg

RNase-Freewaterupto25μl

注意：引物浓度请以终浓度0.1-1.0μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。

3．涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。

4．将热循环仪预热到45℃，将PCR管置于热循环仪中，进行RT-PCR反应。

反应条件：

步骤温度时间

反转录45℃30min

PCR预变性95℃2min

变性94℃30s

退火55-65℃30s30-40个循环

延伸72℃30s

终延伸72℃5min

注意：1）一般PCR实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为20-30秒，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。

2）延伸时间根据扩增的片段大小设定，本产品中包含的DNAPolymerase扩增效率为1kb/30s。

3）可根据扩增产物的下游应用设定循环数。循环次数太少，扩增量不足；循环次数多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。

5．反应结束后取5μl反应产物，加入适量上样缓冲液后进行电泳检测结果。

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