- 用户培训 | SU8700 Workshop 在上海成功举办
- 培训邀约 | 日立高效液相色谱仪综合应用技术培训班
- 会议邀约 | CIBF2024第十六届重庆国际电池技术交流会/展览会
- 地球日 | 趣味答题 赢精美礼品
- 长安大学采购南京大展DZDR-S导热系数测定仪
- 春日盛会邀约 | 福立仪器邀您出席第二十七届高校分析测试中心研究会年会,共探行业奥秘!
- 美正检测为海洋生鲜的快速入市提供安全保障!
- 开启中国新篇章,勾勒未来在华发展蓝图
- 来源:内容来源于网络 浏览量:905次
- 【导读】信帆生物为大家提供:Westernblot实验步骤详解一.实验步骤1.组织块称重2.利用液氮、研钵粉碎组织块3.加入RIPA缓冲液(每克组织3mlRIPA),PMSF(每克组织30...
信帆生物为大家提供:Westernblot实验步骤详解
一.实验步骤
1.组织块称重
2.利用液氮、研钵粉碎组织块
3.加入RIPA缓冲液(每克组织3mlRIPA),PMSF(每克组织30μl,10mg/mlPMSF),利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃
4.加入PMSF(每克组织30μl,10mg/mlPMSF),冰上孵育30分钟
5.移入离心管4℃约20,000g(约15,000转)15分钟
6.上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存
7.进行Bradford比色法测定蛋白质浓度
8.取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度),并加等体积的2×电泳加样缓冲液
9.沸水浴中3分钟
10.上样
11.电泳(浓缩胶20mA,分离胶35mA)
12.电转膜仪转膜(100mA40分钟)
13.膜用丽春红染色,胶用考马斯亮蓝染色
14.Westernblot试剂盒显色
15.分析比较记录
westernblot的实验步骤及注意事项的资料
1.把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1)转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜,将硝酸纤维素膜铺在凝胶上,用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
2)在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸(预先用转移缓冲液浸湿),将凝胶夹在中间,保持湿润和没有气泡。
3)将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中,凝胶面向阴极。
4)将上述装置放入缓冲液槽中,并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5)按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6)转移结束后,取出薄膜和凝胶,弃去凝胶。
2.将薄膜漂在氨基黑中快速染色,直至分子量标准显现时取出,记录下标准位置。
3.用100ml水洗涤纤维素膜,必要时可用脱色缓冲液。
4.膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
5.室温下,用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
6.用封口机将薄膜封入塑料袋中,尽可能不留空气。
7.袋的一角剪一缓冲液的小口,用透析袋夹紧。
8.混合:NGS(100微升),印迹缓冲液中的抗体(10毫升),加在装薄膜的袋中,于室温下摇动2小时(或4℃过一夜)
9.用总体积300mlPBS-Tween缓冲液,分4次在一浅盘中洗涤薄膜,每次75ml。
10.将连接生物素的羊抗兔IgG(40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS)加在袋内,于室温下摇动1小时。
11.按步骤9洗涤。
12.加入抗生素蛋白-HRP(40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS),于室温下摇动。
注意事项:
westernblot中转移在膜上的蛋白处于变性状态,空间结构改变,因此那些识别空间表位的抗体不能用于westernblot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化,再用酶标记亲和素进行westernblot。实验中取胶和膜需带手套。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1.收集蛋白样品(Proteinsamplepreparation)
可以使用适当的裂解液,例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液,裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用试剂盒进行抽提,例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液,可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
2.电泳(Electrophoresis)
(1)SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制,也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2)样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制,也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。
100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白.
(3)上样与电泳
冷却到室温后,把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小,Z好使用预染蛋白质分子量标准。
电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置,低电压可以设置在80-100V,高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求,也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。为了电泳方便起见,也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式,通常把电压设置在100V,然后设定定时时间为90-120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳,或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3.转膜(Transfer)
我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用,但硝酸纤维素膜比较脆,在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。
通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置,可以设定转膜电流为300-400mA,转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过一夜。转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的转膜时间越长,目的蛋白的分子量越小,需要的转膜时间越短。
在转膜过程中,特别是高电流快速转膜时,通常会有非常严重的发热现象,Z好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准,通常分子量Zda的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色,以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色,以观察蛋白的残留情况。
4.封闭(Blocking)
转膜完毕后,立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中,漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤,一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极易产生较高的背景。
用微型台式真空泵吸尽洗涤液,加入Western封闭液,在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体,可以在4℃封闭过一夜。在整个Western过程中我们推荐使用碧云天生产的侧摆摇床,侧向摆动速度比较缓慢,而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。
5.一抗孵育(Primaryantibodyincubation)
参考一抗的说明书,按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。
用微型台式真空泵吸尽封闭液,立即加入稀释好的一抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳,可以在4℃缓慢摇动孵育过一夜。
回收一抗。加入Western洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6.二抗孵育(Secondaryantibodyinucubation)
参考二抗的说明书,按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用微型台式真空泵吸尽洗涤液,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
回收二抗。加入Western洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7.蛋白检测(Detectionofproteins)
参考相关说明书,使用BeyoECL,Western荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白。
洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机,可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。
8.膜的重复利用(Membranerecovery)
如果蛋白样品非常宝贵,可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜,以重复利用蛋白膜。
仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。
相关热词:
等离子清洗机,反应釜,旋转蒸发仪,高精度温湿度计,露点仪,高效液相色谱仪价格,霉菌试验箱,跌落试验台,离子色谱仪价格,噪声计,高压灭菌器,集菌仪,接地电阻测试仪型号,柱温箱,旋涡混合仪,电热套,场强仪万能材料试验机价格,洗瓶机,匀浆机,耐候试验箱,熔融指数仪,透射电子显微镜。
- 2004-09-07 09:23:11
- 标签:
- 收藏(0) 赞(0) 踩(0)
- 随时了解更多仪器资讯,求购、招标、中标信息实时更新,厂商招商信息随时看。大量、齐全、专业的仪器信息尽在仪器网(yiqi.com)。扫一扫关注仪器网官方微信,随时随地查看仪器用户采购、招标需求!
-
Western Blot技术服务|实验技术服务2004-11-23 09:23:21
关键词:WesternBlot技术服务|实验技术服务简介:世界顶尖品牌WesternBlot技术服务|实验技
-
Western-blot 实验原理、实验步骤及试剂选择指南2005-01-29 09:23:06
Western,也称Westernblot、Westernblotting、Western印迹,是用抗体检测
-
信帆生物为大家提供:Western Blot实验操作宝典2004-09-07 09:23:11
信帆生物为大家提供:WesternBlot实验操作宝典!western免疫印迹(WesternBlot)是将
-
哈灵生物实验室教大家——标准物质常用的术语有哪些2004-12-02 09:23:12
哈灵生物实验室教大家标准物质常用的术语有哪些1986年,国家计量局颁布的标准物质术语有:1、标准物质(Ref
-
哈灵生物实验室教大家——胎牛血清使用前的保存规则2004-12-02 09:23:12
哈灵生物实验室教大家胎牛血清使用前的保存规则我公司血清产品仅供实验室科研使用,主要种属有牛(胎牛/小牛/成牛
-
哈灵生物实验室教大家——标准品与对照品的区别2004-12-02 09:23:12
哈灵生物实验室教大家标准品与对照品的区别上海哈灵生物科技有限公司是一家专业经验标准品的公司,标准品和对照品的
-
哈灵生物实验室教大家——牛血清在细胞培养中的作用2004-12-02 09:23:12
哈灵生物实验室教大家牛血清在细胞培养中的作用牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的
-
哈灵生物实验室教大家——血清的主要成份2004-12-02 09:23:12
哈灵生物实验室教大家血清的主要成份血清是一种很复杂的混合物,其组成成份虽大部分已为人所知,但还有一部分尚不清
-
哈灵生物实验室教大家——免疫组化实验成功的关键2004-12-02 09:23:12
哈灵生物实验室教大家免疫组化实验成功的关键众所周知免疫组化实验成功的关键是抗体,如果抗体不好,整个实验就基本
-
哈灵生物实验室教大家——培养细胞的十个诀窍2004-12-02 09:23:12
哈灵生物实验室教大家培养细胞的十个诀窍细胞可是许多生物学实验的主角。如果细胞长不好,那么实验的结果也不会好到
信帆生物为大家提供:Western blot实验步骤详解
-
您可能感兴趣
①本文由仪器网入驻的作者或注册的会员撰写并发布,观点仅代表作者本人,不代表仪器网立场。若内容侵犯到您的合法权益,请及时告诉,我们立即通知作者,并马上删除。
②凡本网注明"来源:仪器网"的所有作品,版权均属于仪器网,转载时须经本网同意,并请注明仪器网(www.yiqi.com)。
③本网转载并注明来源的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品来源,并自负版权等法律责任。
④若本站内容侵犯到您的合法权益,请及时告诉,我们马上修改或删除。邮箱:hezou_yiqi